第六节目的基因的分离.pptVIP

* 利用与目的基因紧密连锁的分子标记DNA片段为探针筛选基因组文库,用已获得的阳性克隆DNA的末端片断为探针继续筛选,如此进行下去,直到获得含目的基因两侧序列为止。这种方法因为以一系列头尾相互重叠探针筛库,类似于从分子标记序列开始通过 一系列序列相互重叠的克隆向目标基因的”行走”因此称为染色体步移。 * 2.3.4.2 染色体登陆 染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃,或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。构建插入片段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子标记之间距离的基因组文库,就可以通过筛库直接获得含目的基因的大克隆,接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移的弊端,这种方法称为染色体登陆 由于筛选出的阳性克隆的插入片段较大而可能包含多个基因,或者由于筛选技术本身引起的假阳性克隆,获得目的基因后仍需进一步证实。常用的方法有: ①通过分子杂交证实候选基型的时空表达与目标性状表现相同 ②在核酸数据库中进行同源性检索,推断其功能 ③转化候选基因功能缺陷的突变株,进行遗传互补实验,能使功能缺陷的突变株恢复功能的为阳性起隆。 * * 2.3.5 生物体并不是所有的基因都在表达,即基因表达具有时空性。mRNA差别显示技术mRNA differential display)是对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离的有效方法之一。它是将mRNA逆转录和PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术,因此也 都为DDRT – PCR（differential display polymerase chain reaction, RT – PCR)。 mRNA差别显示技术原理 绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾,用Oligo(dT) 12MN养共12种(4种M×3种N)逆转录锚定引物,可以将所有的mRNA逆转录成为大致相等但结构不同的12份cDNA亚库,这个过程叫做差异显示逆转录即DDRT。代表专一性表达基因的cDNA在群体中所占的比较低,无法达到分辨的程度,因此必须通过PCR扩增放大后,才有可能达到电泳区分的程度。PCR所用的5’端引物为10 mer的随机引物,选择不同种的5’端随机引物可只扩增总 cDNA中的部分cDNA链。通常采用12种反转录锚定引物和20种5’端随机引物进行 40组PCR扩增,可以得到20 000条左右的DNA条带,每一条都代表一种特定的mRNA,基本重盖了总mRNA的96%。扩增产物经过变性的聚丙烯酷肢凝胶电泳可以显示50 ~ 100条长 度在l00~500bp之间的条带。如果将对照和诱导同时进行DDRT-PCR,电泳结果在同一位置的条带的有无可能显示基因表达的”开”与”关”即基因的特异表达。为了鉴定条带的真假,可以将特异条带回收后测序,进行同源性比较,进而通过Northern blotting鉴定回收DNA是否是组织或诱导特异表达的基因的一部分序列,最后以此阳性DNA片段为探针通过筛选cDNA 文库或直接用RACE方法获得全长的cDNA。 DDRT-PCR技术的特点是: ①具有很强的实用性,应用的前提条件要求低 ②灵敏度高, 丰度低的差别mRNA经过调整条件可以达到直观水平 ③可重复性好, 90%~95%条带在不同反应中可以重复 ④多用途,差异条带不止是特异表达基因的一部分,通常含有专一性表达基因的调控基因在内的部分序列 ⑤但其局限性也很明显,因为获得的差异条带为3’端的差异, 而5’端的差异受所获得DNA条带的长度限制往往检测不到,因此可能是3’ – UTR的序列差异而非编码区的基因序列差异,较易出现假阳性结果。 * * 酵母双杂交体系(two-hybrid system)也叫相互作用陷阱(interaction trap) ,是1989年由 Stanley和Song等提出并初步建立的,并于20世纪90年代初期发展起来的。该系统是在酿酒酵母中研究蛋白质互作的一种非常有效的体内鉴定方法,可有效分离能与靶蛋白相互作用的蛋白编码基因,广泛应用在真核基因的表达与调控、细胞辑合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式作用因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究。 酵母双杂交技术的基本原理 酵母双杂交体系基于许多真核生物转录激活蛋白因子(transcriptional activator)都是由两个结构上可以分开且功能上独立的结构域( domain)组成： 一个是与DNA调控序列结合的 DNA结构域(DNA-binding domain, DNA-BD) 另外一个是与基本转录复合物相互作用启动转录的转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。 如酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录调控激活因子GA