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基因测序及分析 与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制， 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：3~4)。 Sanger第一步：加入复制终止剂 ddNTPs参与下的DNA复制 Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物； “标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。 Sanger第二步：荧光检测 Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关 Analyzed Raw Data 除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。 Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use dynamic programming to match predicted and occurring peak intensity and peak location. Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur. Such as multiple peaks at one nucleotide location, spread out peaks, low intensity peaks. Maxam-Gilbert法 一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。 G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 杂交法SBH （Sequencing by hybridization） 用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。 基因组测序 DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。 先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。 另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。 完整基因组的测序过程一般包括三个步骤： （1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列； （3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。 鸟枪测序法(shotgun sequencing)  大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将