分子生物学实验四.pptVIP

分子生物学实验 实验四 原核细胞质粒DNA的提取 水浴锅 * * 考试 第17周 原核蛋白质SDS电泳 第15周 目的基因的PCR扩增与检测 第14周 质粒DNA的转化 第13周 细菌感受态的制备 第12周 凝胶电泳回收和纯化DNA片段 第11周 限制性内切酶酶切质粒DNA 第10周 紫外吸收测定核酸含量 第9周 核酸的琼脂糖凝胶电泳 第8周 原核细胞质粒DNA的提取 第7周 从动物组织提取DNA 第5周 从植物组织提取DNA 第4周 分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍 第3周 一、实验原理 由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经经EDTA破坏带有质粒的细菌外膜系统，再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性裂解而使胞内DNA全部释放出来。质粒DNA具有较强的耐剪切和耐碱特性（pH12.0～12.6），且恢复中性后又呈天然构型，而染色体DNA仍处于变性状态，用乙酸钾沉淀变性的蛋白质和染色体，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，便可得到含染色体DNA较少的质粒DNA粗提物，可直接用于酶切和转化实验。 二、材料与设备 E.coli 菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台　 三、试剂与配制 1)质粒DNA碱裂解法试剂： 溶液I： 葡萄糖 50 mmol/L EDTANa2 10 mmol/L Tris-HCl （pH8.0） 25 mmol/L 溶液II：（临用时新配制） NaOH 0.2 mol/L SDS（w/v） 1% 0.4mol/L NaOH 和2% SDS（w/v）对半混匀即可。 溶液III：5 mol/L 醋酸钾 60 mL 冰醋酸 11.5 mL DDW 28.5 mL 注意：溶液I、III都须高压灭菌。 2) 氯仿:异戊醇=24:1 3) 无水乙醇；70%乙醇；异丙醇 4) TE（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA　 四、实验步骤： （1）取菌液1.0mL, 7000 rpm离心5min,弃上清。 （2）加入预冷的100?l 溶液I。震荡混匀。室温放置5min。 （3）加入200?l溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次（不要剧烈震荡）, 冰浴放置5min。 （4）加入预冷的150?l 溶液III。温和震荡混匀，冰浴3min。 （5）4℃ 12000rpm离心5min。 （6）取上清至另一干净的EP离心管中，加入400?l 氯仿:异戊醇，混匀。4℃ 12000rpm离心5min。 （7）轻轻取上清至另一干净的EP离心管中，加入800?l无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，充分混匀后，室温静置沉淀5min。 （8）4℃ 12000rpm离心5min，弃上清。 （9）用500μl 70%的乙醇漂洗沉淀2-3次，12000rpm离心5min。 （10）沉淀物自然干燥后加入30?l 含RNAase的TE(pH8.0)，以溶解质粒DNA。 （11）电泳检测实验结果。 五、作业： 1、细菌质粒DNA的提取过程中如何去除细菌基因组DNA的污染？ 2、溶液I、溶液II和溶液III的作用分别是什么？ 微量移液器 使用对应的吸头（枪头）、确认样品的加入。 台式离心机