实验4层析技术血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定.pptVIP

实验四 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 层 析 技 术 固定相—固定不动 流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。 4．分类：①流动相的物理状态：气相和液相→ 气液/固，液固/液②方式：纸、薄层、柱③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相 凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场 电泳用于分离物质的原理 ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 清蛋白（albumin，A）：38～48g/L 球蛋白（globulin，G）：15～30g/L A/G：正常值1.5～2.5 ? ? ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 加样线 加样线 纯化蛋白 对照 样品 【操作步骤】 1．点样：取经巴比妥缓冲液浸透的2×8cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置5～10分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2．通电：接通电源，调节电压为90～110V，通电45 ～ 60min，关闭电源，停止电泳。3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。 c * * 层析技术 实验原理 实验思路 实验流程及操作注意事项 1. 定义：层析法，又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术. 2. 分离依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。 3．基本原理：固定相和流动相 5．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 ②基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液 pH7.4磷酸盐缓冲液 交联葡聚糖凝胶 多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接 ③影响因素 *层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 *洗脱液：溶解待分离物质，不变性 *加样量：1%～5% *凝胶的再生 离子交换层析 定义: 离子交换层析是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行的分离方法. 原理: 离子交换交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混和物中各种离子的一种技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间的吸引力的作用。 分类: 阴离子交换剂 带正电荷，与混合物中带负电的组分结合 阴离子交换层析 阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析 交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数 4×103 ～ 1×105 15～20 40～120 G-100 3×103 ～ 8×104 12～15 40～120 G-75 1.5×103 ～ 3×104 9～11 40～120 G-50 1×103 ～5×103 4～6 50～150 G-25 ＜1.5×103 2.5～3.5 50～150 G-15 ＜7×102 2～3 40～120 G-10 分离范围（Mr） 溶胀体积(ml/g) 颗粒大小（μm) 凝