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第八章 基因重组与基因工程 基因工程：按人为的设计，通过基因克隆技术有目的地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程称为基因工程（genetic engineering）。基因工程就是要改造DNA,涉及DNA序列的重新组合和建造,其核心即是人工的DNA重组。 DNA重组：不同来源的DNA分子通过末端共价连接形成重新组合的DNA分子的过程称为DNA重组（DNA recombination ）。 基因克隆（DNA克隆）：是指在体外对DNA分子按照既定的目的分离、剪切和重新连接，构成重组的DNA分子，然后把它导入宿主细胞，使其在宿主细胞内扩增，从而获得该DNA分子的大量拷贝。由于此克隆技术是在分子水平上进行的，故又称为分子克隆（molecular cloning）。 基因工程、蛋白质工程、酶工程共同构成当代新兴的学科领域——生物技术工程。 第一节 工具酶 限制性核酸内切酶（restriction endonucleases） DNA连接酶（DNA ligase） DNA聚合酶（DNA polymerase） 末端脱氧核苷腺转移酶（terminal deoxy nucleotidyl transferase， TdT） 一、限制性核酸内切酶 （restriction endonucleases） 又称限制性内切酶，简称为限制酶，能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。 5’AACGTTCGAAGCTTTAGGCCCGAT3’ (一)限制酶的命名与分类 限制酶常以4个字母命名，第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、三个字母是细菌的种名，用小写；第四个字母代表株名。另外用罗马字代表同一菌株中不同限制酶的编号。如HindⅢ的H代表Haemophilus属，in代表influenzae种，d代表Rd菌株，Ⅲ代表该菌株中第三个被分离到的限制酶。 限制性核酸内切酶 分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型，基因克隆中所用的限制酶是Ⅱ型酶。 (二) Ⅱ型限制酶的识别和切割位点 Ⅱ型酶的识别序列通常为4～6bp，具有回文结构（palindrom），大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′或3′末端突出的粘性末端（sticky end）。 如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端； 5′－G↓AATT C－3′ 5′－G 5′ AATTC－3′ 3′－C TTAA↑G－5′ 3′－CTTAA 5′ G－5′ PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端： 5′－C TGCA↓G－3′ 5′－CTGCA G－3′ 3′－G↑ACGT C－5′ 3′－G ACGTC－5′ 还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）。如SmaI: 5′－CCC↓GGG－3′ 5′－CCC GGG－3′ 3′－GGG↑CCC－5′ 3′－GGG CCC－5′ 有些限制酶识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isoaudamers），如BamHI（G↓GATCC）和Sau3AI（N↓GATCN）。由此产生的粘性末端称为配伍末端（compatible end），可进行相互连接，在DNA重组中具有更大灵活性。 二、其他工具酶 1.DNA连接酶（DNA ligase）：催化DNA片段之间的3’-5’磷酸二酯键的形成。 2.DNA聚合酶：基因克隆中常用的DNA聚合酶有大肠干菌DNA聚合酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶。 3.末端脱氧核苷腺转移酶：将dNTP逐一加到DNA的3’-OH上。 三、目的基因 在基因工程中，欲要克隆的基因或要表达的基因称为目的基因，又称为目的DNA（target DNA）。 包括cDNA和基因组DNA(genomic DNA)。 第二节 基因载 体 外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要将外源DNA与某种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插入外源DNA片段构建重组DNA分子，并将外源DNA携带进入宿主细胞并进行复制的DNA称为基因克隆载体，简称为载体（vector）。 可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。 一、质粒 （一）质粒DNA的生物学特性 ① 质粒（plasmid）是一些染色体外的环形双链DNA分子； ② 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，大小从1kb至2