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第七章 DNA序列测定 DNA序列测定：DNA sequencing 酶法 或末端终止法： 由Sanger 等人1977年建立； 化学法：由Maxam and Gilbert 等人1977年建立； 自动测序系统：在末端终止法基础上发展而来。 末端终止法 特性：利用DNA聚合酶进行引物延伸反应；其引物是带有放射性标记的，可通过放射自显影检出；双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂；采用聚丙烯酰胺区分长度仅差一个碱基的单链DNA。 原理：双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯键，从而链的随机终止；建立4个系统，就可得到4个套组（nested sets）；在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。 双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP） DNA的序列测定（1）－－ddNTP法 化学法测序的基本原理 将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通过电泳分离读取顺序。 每次只能在一个特定的核苷酸处降解： G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化； A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被嘧啶取代； C+T反应：肼能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落； C反应：在一定浓度的条件下，肼只对胞嘧啶起作用 DNA的序列测定（2）－－化学法 Maxam /Gilbert法 到2030年， 预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。 注： 人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性。 因此共有300万碱基上可能存在差异。 DNA序列的自动测定 基本原理：末端终止法 引物用荧光素标记 测序系统由反应系统，电泳系统及驱控系统组成 ALF expressTM 全自动激光荧光核酸测序仪 400-500bp per sample ABI最新型全自动DNA测序仪 700 bp per sample DNA自动测序原理 DNA自动测序工作站 Pyrosequencing:焦磷酸测序法 仍然根据碱基互补配对的原则 单个核苷酸或碱基按给定顺序发放 通过检测焦磷酸发光反应来判断正确的核苷酸顺序 AGGATCTGAGGCAAG TCCTAGAC… * * Sanger法 DNA测序结果 *
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