第三章提取和分离.pptVIP

基因工程需要三种不同的DNA:总DNA 质粒DNA 噬菌体DNA 学习内容： 制备细胞总DNA 培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物 DNA纯化、浓缩 从其他生物中提取总DNA 质粒DNA提取 根据分子大小分离 根据结构分离 质粒扩增 提取噬菌体DNA 噬菌体的培养 制备非溶源性噬菌体 收集噬菌体 从λ噬菌体中纯化DNA 纯化M13 DNA 1.制备总DNA 1.1培养、搜集细菌细胞 两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基： Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基： Yeast extract(5) NaCl(10) 1.1培养、收集细菌细胞 1.2 制备细胞提取物 利用溶菌酶、EDTA或两者结合。 溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。 EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。 一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SDS。 1.制备细胞总DNA 1.4 DNA的浓缩与浓度测定 最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。 260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml。A260/A280=1.8，1.8 表示含有酚或蛋白质, 2说明有RNA 2 质粒DNA提取 质粒DNA的大小（ 8%）。 DNA的构造 ◇ Alkaline denaturation ◇ Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesium chloride（氯化铯） density gradient centrifugation 2质粒DNA提取 2.1 根据分子大小提取质粒DNA sphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。 问题： 裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA 质粒分子非常大时 ，将与染色体DNA共沉淀 2质粒DNA提取 2.2 根据分子构造提取 碱裂解法 基本原理：在非常窄的pH范围内，非螺旋化的DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.0~12.5,破坏氢键，使DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用SDS（十二烷基磺酸钠）（Sodium dodecyl sulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。 2质粒DNA提取 2.2 EB—CsCl密度梯度离心法 在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。 2.2 EB—CsCl密度梯度离心法 EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。 CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。 2质粒DNA提取 2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。 3 噬菌体DNA的制备 当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。 然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010λ噬菌体，但只能产生500ngDNA。 3 噬菌体DNA的制备 3.1 噬菌体的培养 自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外λ噬菌体，必须经过诱导培养使所有的λ噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放λ噬菌体。 3.1 噬菌体的培养 大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cIts突变体中，cI基因在30°C条件下正常表达，在42°C时，不能正常表达，产生溶菌性。 3 噬菌体DNA的制备 3.3 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集λ噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。 3 噬菌体DNA的制备 3.4 从λ噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的λ噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。 3.5 纯化M13 DNA  每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这意味