DDRT-PCR技术研究进展.pptVIP

DDRT-PCR技术及应用的研究进展 前言 基因在不同组织细胞的不同生长阶段的选择性表达决定了生物的整个生命过程——个体的生长、发育、细胞周期的调控、衰老及细胞的程序性死亡等。因此分离、鉴定差异表达的基因，研究基因转录对了解生命过程的机理、发现具有特殊功能的表达产物有着重要的意义。 DDRT—PCR 早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技术和扣除杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。 哈佛大学医学院Liang 和Struss 博士发明了mRNA差异显示技术，即DDRT—PCR(differ—ential display of mRNA by PCR)。 1994年，Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(mRNA Differential Display PCR)，简称DDRT—PCR mRNA差异显示技术的基本原理及实验步骤 1.1 mRNA差异显示技术的基本原理 首先，用3’端锚定引物(Anchor Primer)(dT) VN作为反转录引物反转录细胞总mRNA，合成第一链cDNA； 然后，在用放射性同位素标记的dNTP存在的情况下，用随机引物(Arbitrary Primer)和与反转录引物相同的锚定引用进行PCR，随机扩增cDNA片段； 将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，通过放射自显影展示并回收多态cDNA片段(即EST)； 将差异带二次PCR扩增并通过Northern杂交来验证、克隆、测序差异cDNA片段。 将所得片段用BLAST与Gen．Bank数据库内的已知序列做比较，确定片段是否是新序列(基因)。 2 mRNA差异显示技术的优点和缺点 1 优点 周期短，操作简便，省去了cDNA克隆和随后的克隆筛选工作，比递减杂交要迅速； 可同时比较2个以上时空特异性及物种特异性表达基因； 灵敏度高，所需RNA的量少，该法用PCR扩增，每做100个反应只需1 Ixg mRNA，而递减杂交则需50 Ixg； 另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重复率可达90％～95％ ，大大提高了试验结果的可靠性。 2 缺点 扩增片段短、假阳性高、检测全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表达的时效性影响等。而最大的问题还是假阳性太高。据研究，假阳性高达70% 所谓假阳性指克隆的DNA片段用Northern杂交时，没有阳性信号 3 DD-PCR中的主要问题及解决办法 内部因素：试剂、酶的质量，引物的类型和纯度，RNA的完整性、浓度和纯度等 3.2　改进DD-PCR方法　 　 (1)用无RNA酶的DNA酶处理总RNA，防止DNA污染。　　(2)使用Tag酶时，批号应相同，不要经常调换。　　(3)PCR循环次数减至30次，提高退火温度，减少非特异性条带。　　(4)把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。　　(5)改变引物长度，如有的在3′端锚定引物和5′端各加上10个碱基，带上EcoRI双酶切位点，如此可显著提高重复性。 3.4 克隆差异片段小的解决方法 差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因， 传统方法是采用cDNA探针从cDNA文库中筛选，比较复杂。 目前,人们多采用 Lauren等创造的mRNA 5′端逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在1～1.5kb之间。 另外还有一种叫RACE(cDNA末端快速扩增)的方法，也比较快速，简便。 4 引物的改进 起初Liang等设计的引物采用了12种锚定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MN和20种不同的随机引物， 缺点：不仅费时费力，由于随机引物长度短导致结果代表性差，而且得到的扩增片段也较小，所以差异条带易呈现假阳性结果 。 Ito等将原本有两个固定碱基的3’端锚定引物变为只有一个固定碱基，使原来l2种引物减至3种(oligo dT 12A，oligo dT 12C，oligo dT 12G)， 优点：减少了每个mRNA样品对反转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些RNA代表性差和RNA数量过多而引起假阳性的现象降到最低程度。 随后又有研究人员对5’端引物进行了改进，随机引物条数改为8条，而且在两端引物上都带上了Hind llI酶切位点，使得差异表达片段的克隆变得更加简便 5 mRNA差异显示技术在动物实验中的应用 栾新红等，利用改进后的银染DD—PCR法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，并进行鉴定，采用BLAST软件对阳性片段进行同源性分析。 结