蛋白质的修饰和表达课件.ppt

蛋白质的修饰和表达;第一节 蛋白质修饰的化学途径;影响化学修饰的主要因素有两方面： 1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。 2、修饰剂的反应活性。;一、蛋白质侧链的化学修饰;;（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前，常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化。 ;;;;;;;;;;二、蛋白质的位点专一性修饰;;;;;三、蛋白质的聚乙二醇修饰;;;四、蛋白质的化学交联和化学偶联;蛋白质分子的固定化;酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋法、共价结合法去实现。 1、交联法 是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。 常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2，2-二磺酸。;;;;第二节 蛋白质的分子生物学改造;一、基因突变技术;（一）定点突变 对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入。 具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。 野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。;;;;2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。 再用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。;;1、制造突变体;DNA shuffling allows accelerated evolution of genes;2、筛选;;;Phage display method (1);Phage display method (2);Phage display method (2): (contd.);;二、基因融合和基因剪接;1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由 （1）通过与一特异性蛋白质或其特意的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯化。 （2）通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白。 （3）与报告分子的融合蛋白结合，应用于蛋白质定位或转基因动物。 （4.）避免被蛋白水解酶水解 （5）改变细胞溶解性，防止包涵体的形成 （6）定向定位在宿主的不同区位。 ;;（2）融合蛋白接头的设计和选择 多个不同模块连接成一个大分子时，其中起连接作用的氨基酸链即为linker。 因素： 长度在10-15个氨基酸之间 具有一定柔性 避免产生二级结构 选择非疏水性的氨基酸，常用序列为 （GGGGS）3。;;4、融合蛋白报告分子 目的：标定目的基因的表达调控 应用：启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导、药物的筛选 特点：1、报告基因应不存在于宿主中或易于和内源性基因相区别2、应当有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子3、报告分子的分析结果应具有很宽的线性范围，以便于分析启动子活性的幅度变化4、报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。;5、蛋白质剪接-内含肽 内含肽：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前体蛋白的氨基酸序列。 表达蛋白连接（内含肽介导的蛋白连接）：通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成C端带有硫酯键或N末端带有半胱氨酸的蛋白质分子。两种蛋白质混合以后，硫酯键和半胱氨酸利用自然化学连接的原理进行自发的连接反应，在硫酯键和半胱氨酸之间形成肽键，从而将两种蛋白质连接起来。;6、tRNA介导的蛋白质工程 在蛋白质工程中，借助于校正tRNA定点掺入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息、改进蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某些新的特征。 增添一个非天然氨基酸到遗传密码中需要创建一套新的组分，包括tRNA、密码子和氨酰tRNA合成酶。 迄今为止超过20个非天然氨基酸被掺入到遗传密码中。;;基因融合的用途; 第三节 重组蛋