第八章DNA序列测定.pptVIP

第十章 主要方法 双脱氧链终止法 PCR法 芯片法 化学降解法 双脱氧链终止法1、基本原理 利用DNA在体外合成过程中，当双脱氧核苷酸参与后，DNA链合成会被终止，并产生了一系列长度不等，末端不同的DNA片段，经过电泳分离后，即可从胶片上读出相关的序列。 在一个模板DNA的测序反应中，设置一套四种反应体系，每一种反应体系除了加不同种类的ddNTP外，其余成分相同。 如在A管中除加入dATP、dCTP、dGTP、dTTP外，还需加入一定浓度的ddATP （32P标记） 。 每种反应中可得到一套长度不等的的DNA片段，经变性电泳分离，放射自显影，用只读法（从下至上）即可从图谱上读出DNA序列。 PCR法 直接测序 循环测序 直接测序 可以直接从粗制的生物样品中测出目的DNA序列。 首先通过PCR从样品中扩增出目的DNA 随后通过电泳将扩增产物的双链DNA同反应剩余的dNTP及引物分开，回收PCR扩增的DNA片段。 对扩增产物进行测序反应。测序引物可以是扩增靶DNA一对引物中的一条，也可以是能与PCR产物杂交的其他引物。 循环测序 原理（单引物PCR） 第一步，PCR扩增的DNA经变性成单链形式， 第二步，32P标记的引物与其中的一条链退火， 第三步，在DNA聚合酶的催化下发生链延伸－终止反应。 循环30次左右 化学降解法 一个末端标记的DNA片段在4组或5组互为独立的化学反应中得到部分降解，其中每一组反应特异性的针对某一种或某一类碱基。通过化学降解的分子具有共同起点和不同的终点。将各组反应产物进行电泳，经放射自显影即可读取其序列。 * * DNA序列测定 待测序列 A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C 3， 5， 双脱氧酶法测定DNA顺序1 引物及固定端 加引物 A C G T T A C G 3， 5， A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C A C G T T A C G 3， 5， 3， 5， ① ② 以2，、3，－双脱氧三磷酸（ 2，、3， dNTP)来中止DNA的复制反应 加[32P]dATP， dTTP， dGTP ，dCTP ③ 分成四份进行反应 双脱氧酶法测定DNA顺序2 ④ 加ddATP/klenow片断 ④ 加ddTTP /klenow片断 ④ 加ddGTP /klenow片断 ④ 加ddCTP /klenow片断 ACGTTACG 3， ddAGGC ddATCTGCAGGC ddAATCTGCAGGC 5， 5， 5， 3， 3， 3， ddTGCAGGC ddTCTGCAGGC ddTAATCTGCAGGC 5， 5， 5， 3， 3， 3， ddGC ddGGC ddGCAGGC 5， 5， 5， 3， 3， 3， ddC ddCAGGC ddCTGCAGGC 5， 5， 5， 3， 3， ⑤ ⑤ ⑤ ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥ 加在序列胶之A行 加在序列胶之T行 加在序列胶之G行 加在序列胶之C行 单链模板DNA 引物 ddTTP ddCTP ddGTP ddATP A C G T 5’C 3’ 5’CA 3’ 5’CAG 3’ 5’CAGA 3’ 5’CAGAT 3’ 5’CAGATT 3’ 5’CAGATTA 3’ 5’CAGATTAG3’ 5’CAGATTAGC3’ 5’CAGATTAGCT3’ 5’CAGATTAGCTC3’ 5’CAGATTAGCTCA3’ 5’CAGATTAGCTCAG3’ donghua 指数 线性 扩增方式 脱氧核苷三磷酸 脱氧核苷三磷酸、双脱氧核苷三磷酸 底物 二条引物 一条引物 引物 普通PCR 循环测序 变性 退火 延伸／终止 ddNTP 化学降解法测序系统中的特异修饰方法 碱基 条件与特点 G pH8.0下，用硫酸二甲酯对N7进行修饰，使C8-C9键对碱基裂解具有特异的敏感性 A+G pH2.0哌啶甲酸使嘌呤环的N原子质子化，导致脱嘌呤，消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 C+T 肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去 C 在1.5mol/L NaCl存在下，只有胞嘧啶可与肼发生明显可见的反应 AC 在90℃，用1.5mol/L NaOH处理，可使A位点发生剧烈断裂反应，而C位点断裂反应微弱 DNA样品制备 待测DNA标记 标记单末端DNA片段的纯化 碱基特异性化学裂解反应 凝胶高压电泳分离 读取序列