荧光定量PCR操作与实验技巧交流会.ppt

扩增效率低 * * 重复性不好 * * Agilent定量PCR仪器软件操作 * * * /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. 测核酸时最好不要用DEPC处理过的水稀释，最好用TE溶液稀释。否则光吸收比在TE中测得的低10-15% * 是否用MB000-A011 50×TAE（PH8.5）更好一些？ * 终浓度那一列限定反应体。此表格写的是荧光定量PCR体系？少二价阳离子和缓冲液 * * * Real-Time quantitative PCR: Hier werden Fluoreszenzfarbstoffe zur Detektion der amplifizierten DNA verwendet. Aufgrund der physikalischen Messverfahren (Photodiode, Kamera oder am sensitivsten mit Photomultiplier) ergibt sich auch hier ein Detektionslimit. Die gemessene Kurve (Rot) wird also mit einem Hintergrundsignal detektiert, für das sp?ter korregiert wird. Um nun die einzelnen Reaktion vergleichbar zu machen wird ein willkürlicher Threshold im exponentiellen Bereich der Kurven definiert. Sobald eine Reaktion diese Threshold-Fluoreszenz erreicht wird der Zyklus als der Cycle Of Threshold (Ct) definiert. In der Real-time PCR vergleicht man nun Ct-Werte miteinander. Cambridge, UK 英国剑桥 * Applications for real-time PCR and the Mx range of instruments * * * 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是国际上广泛用于研究仅属于豆科植物或者与之有关的某些生物过程的豆科模式植物,这些生物过程无法采用模式植物拟南芥进行研究.蒺藜苜蓿的基因组较小,二倍体,遗传学简单,遗传转化相对容易,再生时间较短.2003年,国际间合作的蒺藜苜蓿基因组测序计划已经启动. abiotic stress ? 非生物胁迫 * 这是安捷伦公司和美国农业部共同发表的研究文章，介绍用安捷伦公司的Mx3000PQPCR system来检测食物被感染的病原菌 * allows the event-specific simultaneous detection of 39 single-insert GMOs and their derived stacked events * 1,引物设计2DNA酶 * Real-time PCR应 用 灵敏的序列检测和定量 基因表达分析 序列变异检测 荧光信号检测 病原体检测 GMO 分析 质量控制 法医学检测 芯片结果验证 相对定量 ChIP染色体免疫共沉淀 拷贝数分析 CGH比较基因组杂交技术 miRNA检测 SNP 检测/ 等位基因分型 甲基化研究 Immuno-PCR: 用QPCR检测蛋白 DNA/RNA定量 蛋白稳定性试验 报告基因活性分析 通用技术: and many more ….. 85% 基因表达 48% 芯片验证 27% 数据确认 24% 细胞/病毒定量 13% SNP 基因型 10% 其他应用 (DNA methylation, Forensics, Diagnostics, etc…) Source: 2006 PhorTech International Amplification Instrumentation Agilent 产品在前三个应用中占有很好的位置 65%