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上海交通大学工程硕士学位论文  中文摘要 一种高通量的全基因组甲基化 CpG 岛富集方法的建立 ——MBD2b 蛋白柱层析法 中文摘要 背景 众所周知，肿瘤的形成是涉及到多种基因异常，最终导致细胞生长失控的病理过程。 其发生、发展在本质上是由于细胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活所致。以往对于基因 表达异常的机制研究仅局限于分析其基因机制,包括结构改变(如点突变、缺失、插人等) 和染色体重排等。研究发现，肿瘤细胞中存在着与正常细胞不同的甲基化模式，可分为甲 基化增强、甲基化减弱和甲基化酶 Mtase 水平提高三种类型[1] ,在早期癌、癌前病变，甚至 一些良性病变中即已出现，其总体甲基化水平通常比正常细胞降低，且多伴有某些 CpG 岛甲基化程度的增高，这就是癌基因和抑癌基因表达异常、靶细胞获得增殖功能，而丧失 抑制生长功能的另一重要机制，癌变生成的表观遗传机制( epigenetic mechanism)。 以肝癌为例，筛查发现我国肝癌患者中，其癌肿瘤直径小于 5 厘米者近 50％，切除 后病人的 5 年存活率为 50％；肝癌直径大于 5 厘米者，其 5 年存活率接近 0，因此，加强 肝癌的预防和高危人群的定期监测，早期发现、早期诊断、早期治疗是提高肝癌患者存活 率的关键。高甲基化是导致抑癌基因失活的重要机制，现已证实，启动子区高甲基化导致 抑癌基因失活是人类肝癌的共同特征。P16 是一种抑癌基因，其启动子区高甲基化与多种 肿瘤的发生相关。研究显示，肝癌患者 P16 基因启动子区存在较高的甲基化，因此推断， 检测像 P16 基因启动子区甲基化，对于肝癌的早期诊断可能具有重要意义。目前最常用的 甲基化检测技术，如亚硫酸氢钠/测序法、甲基化特异性 PCR、原位-MSP 杂交、单链核苷 酸引物延伸法、变性高效液相色谱法等都无法对全基因组 CpG 岛的甲基化状态进行高通 量快速的甲基化检测，MBD2b 蛋白柱层析法结合全基因组芯片方法可以解决这一难题。 目的 利用甲基化结合蛋白 MBD2b 具有特异性结合甲基化 DNA 的特性, 建立一种基于 DNA 免疫共沉淀技术的全基因组甲基化 CpG 岛的富集方法，分别对甲基化与非甲基化片 段及肝癌患者和正常人的临床标本进行检  III  测，证明这种方法的富集效率及临床应用的 上海交通大学工程硕士学位论文  中文摘要 可行性。同时，为甲基化异化谱的研究，为癌症的检测，诊断，分期及预后打下一个良好 的基础，对于明确肿瘤发生的分子机理及阐明表观遗传调控在人类疾病中的作用具有重要 意义。 方法 在大肠杆菌中表达重组的 GST-MBD2b 蛋白，通过 Glutathione Sepharose 4B 对重组蛋 白进行纯化，制备成亲和层析柱，利用在不同的盐离子强度下 MBD2b 对甲基化 DNA 和 非甲基化 DNA 的结合能力不同，对甲基化 DNA 进行富集。用甲基化酶 SssI 处理过的 DNA 片段与非甲基化 DNA 片段进行富集条件的摸索，通过不同盐离子浓度的洗脱程度来确定 最佳的富集条件。样品的富集情况分别用 Real Time PCR 及基因芯片进行检测。Real Time PCR 是选取抑癌基因 P16 检测 GST-MBD2b 蛋白柱层析法的富集效率以及在富集时加入不 同长度的经过处理的甲基化与非甲基化拟南芥片段，经过富集后选择其中任意一种片段所 对应引物来检测这种方法对甲基化 DNA 的富集与对非甲基化 DNA 的洗脱效果。芯片检 测是可以高通量的将上述加入的全部甲基化与非甲基化拟南芥片段的富集情况在同一张 芯片上进行检测，将加入的拟南芥片段对应的 PCR 产物作为探针，经过玻片的清洗，硅 烷化、手臂分子的连接、探针的点样及固定等多个步骤制备小芯片。将含有甲基化和非甲 基化拟南芥片段的富集产物与芯片杂交，分析荧光信号值以反应富集情况。此外，还可以 将蛋白柱层析法与全基因组 CpG 岛芯片结合分析正常肝及肝癌中的甲基化情况。 结果 在大肠杆菌中表达纯化了 MBD2b 蛋白，同时试验确定了 0.5M 盐离子浓度是采用 MBD2b 蛋白对甲基化 DNA 片段和非甲基化 DNA 片段进行分离的临界条件。通过 Real Time PCR 及基因芯片检测发现，这种方法能够实现对全基因组甲基化 CpG 岛的有效富集 且内源基因检测到的最高富集倍数可达到 100 多倍，对甲基化的富集率/非甲基化洗脱率 可达到 4000 倍左右，富集方法的稳定性重复性好。 结论 本研究建立全基因组 CpG 岛的甲基化检测新方法，实现了对多位点甲基化的检测， 并用 GST-MBD2b 蛋白柱层析法对甲基化/非甲基化片段及肝癌标本进行了富集分析，证实 了这种方法的有效性，简便性，快速性及联合芯片后的高通量性，这为研