浙江大学细胞培养基础知识课件.ppt

浙江大学细胞培养-基础知识;一、细胞培养物的生长生物学 ;成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起;(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞;（一）贴附(粘附)型细胞 ;+ + + + + + +;细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 ;易相连成片 相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动;成纤维细胞型 ; 排列成放射状，漩涡状 不紧靠连成片，细胞与细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起;体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞;具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。 表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffer cell)以及某些肿瘤细胞等。 ;多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，细胞一般分胞体和胞突两部分：其胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。 体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞 。;细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化 细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标 若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。;培养细胞形态不稳定;（二）悬浮生长型;优点  生存空间大，提供数量多 传代方便 (不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长 (尤其正常细胞) ;二、培养细胞的生长和增殖过程;（一）组织培养细胞生命期 (Life Span of Culture Cells);1、原代培养期 (Primary Culture stage);2、传代期 (passage stage);　原代培养　　　传代培养;一代贴附生长细胞的生长过程;体外培养细胞一代生存期;2.1 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10 min-4 h;;2.2 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）;2.3 潜伏期： 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24 h。;;3、衰退期 特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。;细胞周期;;（一）细胞的营养需要 --培养基;培养基的基本要求;培养基的种类;主要是牛血清 胎牛血清：取自破腹产的胎牛 新生牛血清：取自出生24 h的新生牛 小牛血清：取自出生10-30 d的小牛 主要成分 血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、 生长因子、激素、无机物等;主要作用 1）提供基本营养物质 2）提供贴壁和扩展因子 3）提供激素及各种生长因子 4）提供结合蛋白 5）对培养中的细胞提供某些保护作用;主要缺点 1）改变某种细胞在体内的正常状态 2）血清中含有的某些物质对细胞有毒害作用 3）每个批次血清的成分不能保持一致 4）取材过程中可能污染支原体、病毒等，对培养细胞产生潜在影响;使用前处理 56 oC灭活30 min。 储存条件 一般储存于-20 oC，避免反复冻融，购买大包装后，先灭活，然后分装冻存，使用前4 oC融化。 使用浓度 一般为5-20%，最常用为10%。;低限量Eagle培养基，仅含有12种2必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐。成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。;由Iscove等人在DMEM基础上增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄