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- PAGE 9 - 可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、MDA的测定 一、磷酸缓冲液的配制： 二、酶液的制备：称取0.5—1g（FW）放入研钵中，加5×毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，12000转冷冻离心20分钟，上清液（酶液）倒入试管中，置于0—4oC 三、可溶性蛋白的测定 1、试剂的配制: 牛血清白蛋白标准液（100g/mL）：精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL（4℃ 考马斯亮蓝G-250染色液：取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。 2、标准曲线制作 0—1000μg/ml标准曲线的制作 取6支10ml具塞试管，按下表取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后，在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD值，并做出标准曲线。 表 0~1000μg/ml标准曲线 管号 1 2 3 4 5 6 1000μg/ml母液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 DH2O(ml) 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 G-250试剂(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg) 0 200 400 600 800 1000 OD250 2、样品测定 取2支试管（10ml具塞，作为3个重复），按下表加样： 管号 空白 样品 样品 样品 待测样品(ml) 0 0.08 0.08 0.08 DH2O(ml) 1.00 0.92 0.92 0.92 G-250 5 5 5 5 OD595 0 蛋白质含量 0 3、计算结果 样品中蛋白质含量（μg/gFW）= 其中X为在标准曲线上查得的蛋白质含量，μg；V0为提取的总体积，ml；V1为测定蛋白质时所用的体积，ml；W为样品鲜重，g。 四、SOD的测定： 1、SOD反应液的配制： （1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8 （2）130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml （3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml； （4）100μM EDTA-Na2:取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml （5）20μM核黄素(FD):0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。（取0.0753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml，取10ml稀释至100ml） 酶液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：FD：H2O的比例为0.1：1.5：0.3：0.3：0.3：0.3：0.2，按母液顺序配制。 2、SOD的测定：取型号相同的四支试管，一支做空白，一支做对照（均不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，遮光保存，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光20分钟，以空白调零，560nm比色。 表：SOD反应体系 试剂 空白 （暗处） 对照 （4000Lux） 样品1 （4000Lux） 样品2 （4000Lux） 0.05mol/L磷酸缓冲液 1.6 1.6 1.5 1.5 130mmol/LMet溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 750μmol/LNBT溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 100μmol/LEDTA-Na2 0.3 0.3 0.3 0.3 20μmol/L核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 酶液 0 0 0.10 0.10 蒸馏水 0.2 0.20 0.20 0.20 总体积 3.0 3.0 3.0 3.0 吸光值 0 3、结果计算 SOD总活性（吸光度/g·FW）= 单位：NBT光还原50%为单位 SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度 式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V0为提取酶液的总体积，ml；V1为测定时所用的体积；W为鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。 五、POD的测定： 1、0.1M PH6.0磷酸缓冲液的配制： 2、POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。 3、POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，20S后在470nm下开始计数，每隔20s读数一次，共读两次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mg pr或ΔA470/ mgFW）表示酶活力的大小。 4、结果计算：POD活性（ΔA470/min·gFW）=ΔA470×V0/V1/W