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药物靶标发现与筛选 基因靶标 核糖核酸靶标 蛋白靶标 一、基因靶标 1、在基因数据库中搜寻药物靶标 （1）表达序列标志(expressed sequence tag, EST)数据库 （2）归纳逻辑设计程序 一、基因靶标 2、基因芯片技术 （1）普通基因芯片 （2）ChIP-DSL （coupling ChIP with a DNA selection and ligation strategy ），芯片/DNA选择结扎技术 一、基因靶标 3、基因敲除（knock-out) 技术 一、基因靶标 4、检测报告基因 一、基因靶标 5、低等生物功能基因组筛选 二、核糖核酸靶标 1、 核酶技术 核酶(ribozyme) ● 内含子(intron) 内含子是基因内的间隔序列，它不出现在成熟的RNA分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。 ● 外显子(exon) 最后出现在成熟RNA中的基因序列。 ● 核酶的发现: 1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。 内含子的切除: 核酶的作用机理 除了rRNA前体中有内含子,tRNA和mRNA前体中都有内含子的存在,这些内含子都要通过加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。虽然这些RNA中内含子切除的机理各不相同,但都涉及到核酶的作用。 核剪接(nuclear splicing) 真核生物的结构基因中一般都含有内含子， 转录后，从pre-mRNA中将内含子切除，然后将外显子重新连接成一个成熟的mRNA的过程称为RNA剪接(RNA splicing)。 鸡的卵清蛋白基因中有7个内含子，转录后需要被切除，8个外显子连接起来形成有功能的mRNA。 核酶种类: 发卡状核酶 锤头状核酶 I型内含子核酶 RnaseP核酶 丁型肝炎病毒核酶 二、核糖核酸靶标 2、 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, asON) 人工合成的，与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上,从而封闭基因的表达。包括：反义DNA， 反义RNA， 其来源可有人工合成和体内表达两类。 反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重要工具。大多数药物属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，因此反义寡核苷酸模拟了药物的作用，这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势。同时，那些在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸本身还可以被进一步开发成为反义寡核苷酸药物。 二、核糖核酸靶标 3、 RNA干扰技术 三、蛋白质靶标 1、 抗体和胞内抗体 三、蛋白质靶标 2、生色团辅助激光灭活(chromophore-assisted laser inactivation ,CALI) 三、蛋白质靶标 3、蛋白质组技术 蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 双向电泳分析中的样品制备 制备原则： 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 样品的溶解 是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选