专题四菊花组织培养.pptVIP

细胞的分化 2.离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的一种培养基是MS培养基。 MS固体培养基成分及比例 课外实践（调查） 不是。对外植体进行表面消毒时，既要考虑到药剂的消毒效果，又要考虑到植物的耐受力。 二、实验操作 制备MS固体培养基 外植体消毒 接种 培养 栽培 移栽 冲洗—70%酒精—无菌水冲洗—氯化汞—无菌水冲洗至少三次之上 二、实验操作 （一）制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备。 1、配制各种母液 为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配制成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高10－100倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释。 ①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存。 ②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液。 ③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。 2、配制培养基 分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml。 ① 配制培养液 配制1LMS培养基，先将称好的琼脂加800ml蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml。 ② 调pH ③培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素。 3、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起 进行高压蒸汽灭菌。 1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。 （二）外植体消毒 2、消毒 ①流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。 ② 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干表面的水分。 ③消毒液处理 取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液，用无菌滤纸吸干表面的水分。 （三）接种 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟。 1、接种室消毒 2、无菌操作要求 操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。 超净工作台的紫外灯照射消毒 3、材料的切取和接种 将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种6－8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好。 4、接种注意事项 ①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。 ②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。 ③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。 （四）培养 1、愈伤组织的培养 首次培养愈伤组织时，在无光条件下愈伤组织长的更快。 2、愈伤组织的继代培养 培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。 3、试管苗的培养 当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养。 思考： 你打算做几组重复？ 你打算设置对照实验吗？ 观察记录 试管苗 （四）培养 1、愈伤组织的培养 从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。 继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养。 2、愈伤组织的继代培养 在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色。 （五）移栽 移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管