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2011-9-24 基因工程基本操作 * （三）植物病毒RNA提取 取提纯的病毒颗粒TMV 等体积酚/氯仿抽提 取上清 等体积酚/氯仿抽提 取上清 等体积氯仿抽提 乙醇沉淀 第三节核酸电泳 2011-9-24 基因工程基本操作 * 1.基本原理 DNA或者RNA中磷酸基团是呈离子态的，可以说DNA和RNA的多核苷酸链可以叫做多聚阴离子，在电场下会向正极移动。 2011-9-24 基因工程基本操作 * 2.迁移速率的决定因素 DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比 琼脂糖浓度　 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同 DNA分子的构象 　 超螺旋DNA移动环状线状双链DNA 2011-9-24 基因工程基本操作 * 电源电压  在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大。 电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围减小 电压不得超过5v/cm。 嵌入染料的存在 　 EB嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。 2011-9-24 基因工程基本操作 * 离子强度影响  电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 2011-9-24 基因工程基本操作 * 3.电泳缓冲液 TAE：含EDTA (pH8.0)、Tris-乙酸 TBE：Tris-硼酸、EDTA TPE：Tris-磷酸、EDTA 一般配制成浓缩母液，储于室温。 2011-9-24 基因工程基本操作 * 4.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖 是一种线性多聚化合物，从红色海藻产物琼脂中提取出来的。 胶的分辨能力与浓度有关。 DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 琼脂糖浓度% 分离范围/kb 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~3 2.0 0.1~2 2011-9-24 基因工程基本操作 * 低熔点琼脂糖（LMP） 用于分离纯化DNA片段 EB的染色原理 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光。 2011-9-24 基因工程基本操作 * 2011-9-24 基因工程基本操作 * 5.脉冲电场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis，PFGE 作用 分离超大分子量的DNA分子，如整条染色体（长达到107 bp的DNA分子）。 原理 （1）在脉冲电泳中，加在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间在交替的改变，DNA迁移方向随之改变。 （2）大分子量DNA的调整要比小分子量DNA的调整需要更多的次数来更换其构型和方位，因此它的迁移率就会慢一些。 a b c 2011-9-24 基因工程基本操作 * 思考题 碱法提取质粒的原理 影响DNA迁移率的因素有哪些 脉冲电场凝胶电泳原理 * * * * 1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。　　 1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 　　2、研磨液室温放置5分钟，