血红蛋白的提取和分离shk.pptVIP

血红蛋白的提取和分离; 学习目标;2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。;思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？;思考3 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;提取分离方法;一、基础知识;3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。;;;1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。;3、缓冲溶液的配制;㈢电泳：;;;（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶;为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。;聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。;电泳检测PCR结果;二、实验操作;二 实验操作;;;每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。;①目的：去除（ ） ②方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层（ ）的红细胞液体倒入（ ）;再加入用（ ）的（ ） 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10min，（ ）离心.; 洗涤过程图解;(2)血红蛋白的释放;;用 过滤，除去 ，于分液漏斗中静置片刻后，分出下??的红色透明液体。;分离血红蛋白;取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，目的是 （ ） 或用于更换样品中的（ ）。 透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。;;小结：样品处理和粗分离;2.凝胶色谱操作----;⑴凝胶色谱柱的制作：;材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:;(3)样品的加入和洗脱;;3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）;知识总结;影响蛋白质分子运动的因素;观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 ;3、血红蛋白的分离是否成功;课后练习;2．提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。 ;;课后练习(P70);容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。;2．在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变