基因诊疗专题知识讲座讲义.ppt

（二） β地中海贫血的基因诊断 PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）→合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对，分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法 三α地中海贫血的基因诊断 a c 左侧缺失4.2kb 右侧缺失3.7kb b b b a α2 α1 α1 α2N端α1C端 正常基因序列 PCR扩增法——定性分析 左侧缺失型基因序列 右侧缺失型基因序列 ac扩增0.4kb ab无扩增片段 ab扩增1.2kb + ﹣ 0.4kb 1.2kb 正常人 右侧缺 失患者 地中海贫血患者基因组的PCR分析 左侧缺失患者 四、杜氏肌营养不良症（DMD） 1. DMD是常见的性连锁隐性遗传病， 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。 　　DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。 （一）DMD分子基础： 抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%） （1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。 （5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。 1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸 酪氨酸→多巴→儿茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。 苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝） 五、苯丙酮尿症（PKU） （一 ） PKU分子基础 （1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。 ①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分析法。 ②PCR/SSCP ③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。 （二）PKU的DNA诊断 先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT 利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症 利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症 ▽ ◎ △ ▲ ○ ◎ △健康男性 ▽男性携带者 ▲男性患者 ○健康女性 ◎女性携带者 ●女性患者 ● ▽ 正常探针 突变探针 第三节 肿瘤的基因诊断 1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 2 检测肿瘤相关基因 癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因 3 检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV－肝癌 EB－鼻咽癌 4 检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA） 肿瘤基因诊断的策略 肿瘤标记物基因的检测 着丝粒 染色体 22 bcr gene c- abl gene 染色体 9 bcr-mRNA bcr-abl mRNA 染色体 9, 22 bcr-abl 融合蛋白（具PTK活性） 慢性骨髓白血病 引物A