基因编辑技术讲义.ppt

基因敲除的原理 ② ① 基因突变 RNAi ③ 同源重组 RNAi引起基因敲除的机制 同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除 适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞; 原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上 同源重组引起的基因敲除 单交换 双交换 图1 图2 同 源 重 组 原 理 图 示 构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择 疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择 neor 和HSV-tk作双重筛选 存活的ES细胞 将重组体导入ES细胞，体外培养 显微注射 回交得到X被敲除的动物 表型分析 同源重组引起的基因敲除—ES细胞 技 术 路 线 图 示 ZFN 技术原理 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基； 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列； 构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。 ZFN 技术 锌指核酸酶介导的定向染色体删除 研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。 崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改 （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段删除 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗 崭新的技术解决经典的挑战 靶向基因技术 经典方法 ： 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！ 饱含希望与失望的技术： ZFN，被Sigma公司垄断 新的里程碑： TALEN TALEN技术 基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。 1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程 人工构建TALE模块识别指定核酸序列 102碱基模块单元 …… 14 – 18个重复 真核表达 …… 14 – 18个重复 特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合 34氨基酸单元 TALEN 发展过程 TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 基因敲除 X 2 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体 TALEN介导的同源重组 同源重组发生率升高几个数量级 Donor plasmid HR Donor plasmid Left arm Right arm Donor plasmid Left arm Right arm 点突变 片段删除 基因敲入 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinject