实验二叶绿体分离荧光观察.ppt

实验二 叶绿体的分离与荧光观察 实验目的 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离 在等渗溶液中进行组织匀浆、分离 叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行 利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光） 常用的细胞破碎方法 离心分离技术 离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。 分离各种细胞组分的方法主要有： 差速离心 密度梯度离心 速率-区带梯度离心 等密度离心 差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。 优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。 速率-区带梯度离心和等密度梯度离心 两种密度梯度离心方法的异同 表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间 各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数 荧光 荧光显微镜观察荧光现象： 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光,称为自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。 有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为间接荧光。如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。 荧光染料:吖啶橙(acridine orange ) 吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料 在紫外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激发出530nm的荧光发射峰(细胞核发亮绿色荧光)，RNA可被激发出640nm的荧光发射峰(核仁和胞质RNA发桔红色荧光)。 产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA 和单链DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。DNA是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。 我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA. 加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光（火红色）消失了？ 原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳香杂环阳离子型染料，可透过细胞膜，因此而推测吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子的结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭的。 实验用品 材料： 菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO) 仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸水纸等 实验步骤 菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨(冰浴)→匀浆过滤(2层尼龙网)→滤液在1000rpm离心2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min →去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 →滴片观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察 实验结果 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。 荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。 注意事项 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 离心机使用：离心管要平衡 荧光显微镜使用 荧光显微镜检要在光线尽量暗