第五章基因工程的操作过程.pptVIP

一、 DNA的体外重组（切与接） 二 重组DNA分子导入宿主细胞 3、大肠杆菌的转化（transformation） 将重组DNA分子引入感受态细菌（competent cell）,使其在细菌内扩增及表达的过程，1970年建立此技术。 感受态细菌： Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，利于外源DNA吸收，细菌细胞此时的状态叫做感受态 。 CaCl2转化的原理： 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，细胞膜通透性增加，处于感受态；此时重组DNA与Ca2+形成羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后进入细胞，在培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，转化效率为105~106个细胞/ug。 转化 1）从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。 2）加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μL），轻轻摇匀，冰上放置30min。 3）42℃水浴中热击 90s ，热击后迅速置于冰上冷却3-5min 4）向管中加入1mL LB液体培养基（不含 Amp），混匀后37℃振荡培养 1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（如Ampr）。 经过转化的感受态细胞在Amp+培养基上长出的单菌落 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1） 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右比较合适(不同的菌株情况有所不同) 。密度过高或不足均会影响转化效率。 （1）磷酸钙-DNA共沉淀法： 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形成出现时，可使DNA黏附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%-5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，用于贴壁细胞转染。 瞬时表达和稳定表达 脂质体介导的哺乳动物细胞转染 实验材料 宿主细胞CHO（贴壁细胞） 脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 6孔细胞培养板 无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 转染级质粒 如用于筛选稳定表达的单克隆细胞株，转染24小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以1000个细胞/孔的密度传于96孔板。培养10天左右，有克隆形成，再进行有限稀释法筛选单克隆细胞。 5、电穿孔法（electroporation） 在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。此法不需要制备感受态细菌，对哺乳动物细胞、酵母细胞和大肠杆菌等细菌都有效，但转化效率差别很大。总体来说转化效率比较高，可达109~1010/ug。 [原理]利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。 4)电击，对大部分哺乳动物细胞，电压为250-400伏，即625-1000v/cm，电容为960uF。在此条件下，电击时间大约在30-50毫秒。不同的细胞电转的最适条件不同。 5)电击结束后，将细胞置于冰上10分钟。 6)电击后，细胞移入非选择性培养基培养。培养24小时后，计数，稀释15倍以上，用选择培养基培养。2-4天换液，直至抗性克隆形成。也可用于筛选稳定表达的单克隆细胞株，细胞电击24小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以1000个细胞/孔的密度传于96孔板。培养10天左右，有克隆形成。 三 转化子的筛选和鉴定 二氢叶酸还原酶基因 新霉素磷酸转移酶基因 Shble蛋白基因 潮霉素磷酸转移酶基因 电穿孔转染质粒DNA1) 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。2) 胰酶消化收集贴壁细胞，离心收集细胞。用磷酸缓冲液洗细胞两次。 3) 弃上清，用0.5ml电转缓冲液重悬细胞，细胞浓度最好在2×106-2×107之间。细胞悬液移入0.4cm（细菌用0.2cm的电转杯）电转杯中，加入5-40ug质粒，轻弹混匀。置于冰上10分钟。 5、转化率 定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。 由于在一般的转化实验中，