实验三基因的PCR扩增技术.pptVIP

实验三 基因的PCR扩增技术 一、实验目的 学习PCR反应的基本原理与实验技术 从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791（PE19）基因 二、基本原理 PCR类似于DNA的天然复制过程。 将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍。 体内DNA的复制 DNA聚合酶 dNTP 解旋酶类 引物 5’ 3’ 加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 总体积 25-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系 三、实验材料 BCG基因组DNA 10?PCR反应缓冲液、4?dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物 （P1、P2）、超纯水SW PCR反应管、移液器、 PCR仪、离心机 四、实验步骤 引物设计 准备PCR反应溶液 PCR扩增反应 结果检测 Rv1791-F： ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoR I） Rv1791-R： ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG （XhoI） （二）准备PCR反应溶液 10×PCR反应缓冲液 2.5μl 4×dNTPs 2.0μl 引物P1 1μl（10nM） 引物P2 1μl 模板DNA 2μl Taq DNA聚合酶 0.2μl 用无菌去离子水至 25μl ↓ 用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀 ↓ 在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底 在PCR仪中设计如下反应程序：94?C、5min；94?C、30sec，61?C、40sec，72?C、30sec，30个循环；72?C、5min （三）PCR扩增反应 将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中，盖好盖子 进行反应。反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用 （四）结果检测 本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp，适合于在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ul PCR产物进行电泳检测。 1 2 3 4 5 循环 94℃ 30s 56.5℃ 40s 72℃ 60s 94℃ 30s 57.7℃ 40s 72℃ 60 94℃ 30s 58.6℃ 40s 72℃ 60s 94℃ 30s 59.9℃ 40s 72℃ 60s 94℃ 30s 61.1℃ 40s 72℃ 60s 五、思考题 影响PCR结果的因素。