Western Blot 实验实用技术手册.docVIP

Western Blot 实验技术手册 Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一. 一、Western Blot基本操作流程图 细胞/组织蛋白提取 ↓蛋白定量、蛋白变性 上样、电泳 ↓ 一转膜 ↓ 封闭 ↓ 孵育一抗 ↓洗膜 孵育二抗 ↓洗膜 底物孵育 ↓ 曝光或显色 二. Western Blot操作步骤 1.蛋白提取、处理 蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品. 对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂， 然后吸净PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）， 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. 对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).，4℃ 提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford法、和Lorry法或BCA法，一般推荐用BCA法. BCA测定方法如下: A． 酶标板操作 1.??????? 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白标准溶液（μL） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（μL） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（μg） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 3、各孔加入200μL BCA工作液； 4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃ 5、稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃ 6、根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/ul）。 三、样品处理 一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸 5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加热 5-10分钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本混合后变性上样即可，为了减少样品的稀释比例，也可制备4 X或6 X的上样缓冲液，如果上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本1：1混合后变性上样即可. SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS电泳可将不同分子量的蛋白分离开。 四、PAGE电泳分离蛋白和转膜、封闭 1）、 电泳 聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的 %C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。不同分子量的蛋白选择