蛋白质的定量分析_BCA法.pptVIP

知识回顾Knowledge Review 蛋白质是生命活动中的重要生物大分子，是遗传信息的执行者，人类几乎所有的疾病都与蛋白质有关系。蛋白质定量分析不仅可以帮助我们测定样品中蛋白质的含量，在广泛的蛋白质研究领域发挥着重要的作用，而且还可以帮助人类诊断疾病，所以学习蛋白质定量分析技术十分必要。蛋白质的组成特点和一些理化性质是蛋白质定量分析的基础，赋予了多种特有的蛋白质定量测定方法。 每种方法都有各自的优缺点，对于不同的实验可以选择不同的方法。本次实验我们主要学习BCA法测定蛋白质的含量。 提问：蛋白质的元素组成有哪几个：C H O N S P 16%代表什么意思？ 简述凯氏定氮法的原理：将蛋白氮转化为氨，用酸吸收。通过测定氨的含量来计算蛋白质的含量。 提问：BCA法理论依据是什么？ 蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。 蛋白质定量分析：BCA法 实验二 主要内容 一.实验目的 二.实验原理 三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法 一.实验目的 1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度； 3、了解蛋白质含量测定的多种方法。 二.实验原理 OH- +2BCA 螯合物（紫蓝色） 562nm A值 标准曲线法 M待测 蛋白质 + Cu2+ Cu+ C待测 二.实验原理 紫蓝色 562nm A待测 含量（ug） A M待测 BCA法测定蛋白质含量的标准曲线 仪器型号:722型分光光度计 作图人:徐先林 时间:2012年9月11日 三.实验操作 实验材料 1、器材 722型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。 管号 试剂（ mL ） 空白管 1 2 3 4 5 测定管 标准蛋白溶液 （ 0.3mg/ml ） — 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 — 蒸馏水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 — — 待测样品 — — — — — — 0.5 BCA 工作液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质含量 ug 30 60 90 120 150 表1 BCA法测定蛋白质含量 数据有改动 将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm 波长比色测定吸光度值。 空白管？ 1-5号管？ ？ 水浴锅 1、以牛血清蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐 标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制标准曲线） 2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 C= M V —— ×250 实验结果记录 管号 空白管 1 2 3 4 5 测定管 M(ug) 0 30 60 90 120 150 ？ 吸光值(A) 测定三次求平均值 四.注意事项 1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等 6、实验原始记录书写规范，三线表 一 五.蛋白质定量分析方法 BCA法 二 Folin-酚试剂法 三 紫外线（UV）吸收法 四 五 考马斯亮蓝结合法 凯氏定氮法 六 双缩脲法 蛋白质元素组成特点 紫外吸收特性 呈色反应 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物 紫外线吸收法 较低 快速 酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 核苷酸 改良凯氏定氮 低 费时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮 双缩脲法 低 中速 肽键和碱