原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）
人工肝实验室学习 姚瑶
目的蛋白提取：
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP管内，-20℃
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做）
5、4℃
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用
（二）蛋白含量的测定：
1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS电泳：
（1）清洗玻璃板
（2）灌胶与上样：
1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
凝胶浓度（%）
分子量范围（KB）
5
25-200
10
10-70
15
50
20
40
以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例：
10%分离胶 5%浓缩胶
去离子水 1.9ml 2.1ml
30%聚丙烯酰胺 1.7ml 0.5ml
1.5M Tris-HCl（Ph8.8） 1.3ml
1.0M Tris-HCl（Ph6.8）
10%SDS 50ul 30ul
10%AP 50ul 30ul
TEMED 2ul 3ul
2、处理蛋白：计算含20-50ug蛋白的溶液体积即为上样量，加入上样量等体积的2×上样缓冲液Buffer，再加入上述总体积1/10的β-巯基乙醇，混匀后，放入PCR仪内，95℃
3、加样：加入1×Tris-甘氨酸电泳液，电泳液至少要漫过内侧小玻璃板，取下梳子，安装好电泳槽，倒入缓冲液，微量加样器加样。需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。
（3）电泳：100V，20min，待溴酚蓝成一直线后，150V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳(一般1.5h)，取出跑好的凝胶，切胶至适合大小。进行转膜。也可在转膜前验证是否有目的条带，使用考马斯亮蓝液置于摇床 染色12h。染完后观察，用脱色液脱色，20min/次，直至透明。再进行转膜。
（四）转膜：
配制1×转膜缓冲液（现配）。一般配制成10×转膜缓冲液储存。需要时配制成1×现用。PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、赶走气泡、胶与膜的位置、膜的正反面。
放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。（大小：凝胶滤纸PVDF膜）
（五）免疫反应：
1、5%脱脂奶粉封闭，4℃
2、一抗孵育。
3、洗膜：PBST/TBST洗
文档评论（0）