单克隆抗体制备讲义.ppt

单克隆抗体制备;;一、免疫血清的制备 1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。;免疫原 1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。 2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电 泳纯即可。 3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～ 1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的 1/2～1/3。 ;4. 抗原的处理 1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。 2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。;佐 剂 1. 概念 佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。 2. 种类 1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂 多糖（LPS）、细胞因子； 2）氢氧化铝、明矾； 3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双 链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）； 4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物 （ISCOMs）、CPG寡核苷酸。;3. 弗氏完全佐剂 1???成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。 灭活卡介苗（2～ 20mg/ml）。 4. 弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 剂。 5. 用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。;动 物 选 择 对免疫动物的主要要求有： 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制 备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。 2. 动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。 3. 性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。;免疫方法 1. 免疫途径 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。;2. 可溶性抗原免疫 1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行 加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。 2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、 小鼠眶静脉少量采血，分离血清，免疫双扩实验 测定血清效价1：32或ELISA法测定抗体效价 1：10 000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉 或心脏全部血液，分离血清。 4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需4～5 次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免