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参考学习
胶回收方法全攻略
说到电泳凝胶的片断回收,想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实,一般在各个和分子 生物学沾到一点边儿的实验室里,从琼脂 糖凝胶中回收DNA,仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳 片断回收没有1—2个小时是搞不定的,每个实验室也有自己的独门秘诀,可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途,不同价钱的快速凝胶回收试剂盒,一下子将 胶回收的时间缩短到10多分钟,操作也大大简化,胶回收就变成“小菜一碟”了。然而,从bbs逛上一圈下来,发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单 的操作而烦恼。到底是什么导致了实验新手,甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比 如酶切连接、转化筛选、测序 或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等,为大家搜罗各种产品和方法的优缺点,注意事项,做一个胶回收全攻略篇。
一、胶回收的关键参数
胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收,无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂,最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度),回收效率,操作方便(速度),柱子的载量等等。
回收产物质量:回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中,普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖,会连同DNA一起从凝胶中抽提出来,会强烈抑制后 继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断,产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收,质量还包括了产物的完整与否,如果机械剪切力使得回收产物大小不一致,后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收,质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小,对后继实 验同样也有影响,比如连接、标记实验等等就很不爽,往往不得不再浓缩一次,增加了操作的复杂性。此外,极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会 对结果产生致命的影响。
回收率:回收得率,是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少,电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失,因而尽可能多的回收电泳凝胶条 带中的目的片断,提高产物得率,对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关,比如DNA片断越大,和固相基质的结 合力越强,就越难洗脱,回收率就低;又比如说,DNA的量越少,相对损失越大,回收率越低。因此,根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是,由于 样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。
其他:操作方面,相信大家都会比较喜欢操作简单,快速,应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂,可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便 的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量,就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了,因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质,过量的 产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物,大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子,多郁闷啊。
二:胶回收方法和分类
20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代,1973年冷泉港实验室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA和EB染料观测DNA相结合的技术。现在,琼脂糖和聚丙烯酰胺 凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。生物通将在后面另文讨论聚丙烯酰胺 凝胶电泳片断
回收的方法,这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法:
1.柱回收试剂盒:可谓目前最简单快速的回收方法,只需要将电泳凝胶中的产物条带切下,用溶解Buffer彻底溶解,上包埋有纯化填料的纯化柱,离心,再 洗涤一次,离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟,得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧 就能得到稳定的结果,也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。
2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒:这个方法比前面的方法更为灵活,可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量,使得实验不受限于柱子的载量, 也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样,将电泳凝胶的条带切下,Buffer溶解,(区别在于这里)加入纯化填料填料吸附混合,快速离心沉淀去上清, 洗涤沉淀后,干燥沉淀,最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来,离心,取上清,就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断,特别是大片断的回 收,但是操作就较前者复杂一些,涉及到多次离心沉淀和取上清,有可能会误吸了微量的沉淀;另外干燥的程度也有点技巧,干过了不好洗脱,没干透又影响结果
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