实验七--外源基因在大肠杆菌中的诱导表达.pptVIP

分子生物学实验Experiments of molecular biology 实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 【目的要求】 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法 【实验原理】 本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。表达蛋白可经SDS检测。 IPTG诱导原理： E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 原核表达： 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。 大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 大肠杆菌中表达体系的缺点： 大肠杆菌表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 典型的表达载体应具有以下几种元件： 1、选择标志的编码序列；2、可控转录的启动子；3、转录调控序列(转录终止子、核糖体结合位点)；4、一个多限制酶切位点接头；5、宿主体内自主复制的序列。 【实验器材】 空气恒温振荡器，三角烧瓶，电泳仪，垂直电泳槽，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL），EP管，凝胶成像系统等。 【实验材料】 重组大肠杆菌，IPTG（在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。），5x蛋白加样缓冲液、无菌水等。 【实验内容】 1．外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 2．最佳蛋白收获时间的确定等 三、实验方案 接入含AMP（50ng/mL）的50ml的LB培养基里，置入摇床中震荡培养，待OD600值达到0.8后，加入500μl的IPTG（24mg/mL）溶液，混匀后，先取出0.5ml菌液，标记为t0。再将菌液置入恒温摇床37℃震荡陪养，每隔半小时分别取出菌液0.5ml。本实验一共连续诱导大肠杆菌表达目的基因的蛋白2.5个小时。 样品取出后均需13000转/分钟离心2分钟，去上清，菌体沉淀置于-20度冰箱，下节课待用。 加入80ul的去离子水把菌体充分悬起后再加入20ul的5×SDS上样缓冲液混合，在100℃水浴5分钟，离心12000转/分钟，离心1min，取上清液，做好诱导时间标记。。 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。 2、超声破