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溶血空斑实验;实验目的;实验原理;●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞 ），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 ;;实验材料与试剂;②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ）
③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml
④补体：新鲜豚鼠血清
⑤??牛血清：56℃灭活 30min;实验步骤;（二）倾注底层琼脂
将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴锅中预温。 ;（三）表层琼脂的制备
将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：
⑴ 20%SRBC悬液0.1ml。
⑵ 小牛血清0.1ml。
⑶ 5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育2h。 ;（四）加补体
从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。;结果判定;注意事项;3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。
4．脾细胞的活力：?为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。
5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。;6．补体的活力：补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。
7．空斑计数：要求判读准确，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。 ;所以器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温。
SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准确。
免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个体差异大，难以比较，最好先作几次预实验，使每个玻片空斑数控制在100-200个为宜。;思考题
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