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高效液相色谱法HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY 中山大学公共卫生学院 肖 琴 Ka 的大小取决于组分分子和吸附剂之间以及组分分子和流动相之间作用力的强弱 Ka 值大，表示组分在吸附剂上保留强，难以洗脱 Ka 值小，表示组分在吸附剂上保留弱，易于洗脱 对吸附剂的基本要求： 不与流动相和被测组分发生化学反应 有高的吸附容量 不溶于流动相等 加热去水过程称为活化 含水量大，吸附活性(能力)低，反之吸附活性高 与硅胶一样，氧化铝也能强烈地吸水，水不易被其它化合物置换，因而使其活性降低 通常也采用加热方法使其活化 流动相极性越大，对被测组分的洗脱能力越强 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（strength parameter）?0 来衡量 ?0 越大，表示洗脱剂的极性越强 可用两种或两种以上的溶剂，按一定比例组成混合溶剂进行洗脱 也可在洗脱过程中采用逐渐改变混合溶剂的比例，使其性质逐渐变化，使结构相似的组分得到分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱 (gradient elution) 梯度洗脱可提高分离效率，减少色谱峰拖尾现象 固定相是涂渍在惰性载体表面上的固定液 担体 (support) 担体又称载体，仅起负载固定液作用，是惰性的多孔固体颗粒。要求其有较大的比表面积，且对样品无吸附作用 常用的担体有吸水硅胶、硅藻土、纤维素和微孔聚四氟乙烯小球等 对流动相的基本要求： 与固定液不互溶，极性相差较大； 对样品组分的溶解度足够大，但又相对小于固定液对组分的溶解度 正相分配色谱 (normal phase chromatography) 反相分配色谱 (reversed phase chromatography) 以离子交换剂为固定相，利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的液相色谱法，主要用于离子型化合物的分离 离子交换色谱的柱填料是一种带电荷官能团的固定基质。固体基质上带负电荷的称为阳离子交换剂，带正电荷的称为阴离子交换剂 为保持交换剂的电中性，基质上还存在带相同电荷数但正、负号相反的离子，称为反离子（也称可交换离子） 分类 按机械强度不同 软质、半硬质及硬质凝胶 按化学成分不同 有机和无机凝胶 按制备方法和孔穴结构差异 均匀、半均匀和非均匀凝胶 按对溶剂的使用范围不同 亲水性、亲油性和两性凝胶 能溶解试样，并且与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶 溶剂的黏度要低 与采用的检测器相匹配 小 结 掌握HPLC的基本理论 熟悉HPLC的分类、特点及应用范围 了解HPLC和经典液相色谱法、GC的区别 了解HPLC的优点 二极管阵列检测器光路图 三维色谱-光谱图 时间 波长 吸 光 度 2. 荧光检测器 （fluorescence detector FD） 原理及仪器结构与荧光分析法相同 荧光检测器的特点： (1) 灵敏度更高，比紫外检测器高3～4个数量级，检测 限可达10-12～10-14 g/ml (2) 对温度和流动相流速的变化不敏感 (3) 可进行梯度洗脱 具有荧光特性的样品 受紫外光激发后发射荧光，在一定条件下其荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 ——选择性检测器 三、离子交换色谱法 (ion-exchange chromatography) (1) 离子交换原理 离子交换原理示意图 待测组分离子Xm与可交换离子Ym争夺离子交换剂上带电荷的交换基团Rs，进行离子交换 溶剂分子 待测组分X （离子型化合物） 离子交换剂 带电荷的 活性基团R 可交换离子Y Xm + RsY Ym + RsX KXY = [Rs X] [Ym ] [RsY ] [Xm ] 其交换反应如下： 反应达平衡时，平衡常数为： 平衡常数 KXY 又称为离子交换反应的选择性系数 (2) 固定相 按可交换的活性基团不同分类 －NH2, －NHR或－NR2 弱碱性阴离子交换剂 －N+R3X- 强碱性阴离子交换剂 －COOH 或－PO3H- 弱酸性阳离子交换剂 －SO3H 强酸性阳离子交换剂 活性基团 分类 按基体不同分类 按物理结构不同分类 按活性基团接入基体的制备方式不同分类 合成树脂(聚苯乙烯)型、纤维素型和硅胶型 微孔型(或凝胶型)、大孔型、薄壳型或薄膜型等 物理涂渍型和化学键合型 离子交换剂的不同物理结构 (a) 微孔型; (b) 大孔型; (c) 薄膜型; (d)表面多孔型 离子交换树脂的主要性能指标 交联度 (degree of cross linking)