第九章固定化酶.pptVIP

9.5 固定化细胞 固定化细胞今后会超过固定化酶的发展 原因: 1. 降低成本; 2. 固定化细胞比固定化酶简便; 3. 可作为单一酶使用，也可作复合酶系完 成部分代谢和发酵过程。 第九章 固定化酶 9.5 固定化细胞 方法： a)直接固定化----利用热、冰冻等手段固定 化（如加柠檬酸、凝剂等）。 1．使菌体内的蛋白酶变性，保护所需酶 2．使菌体内酶固定住，防止损失或损 3．颗粒增大防止酶损失 第九章 固定化酶 第九章 固定化酶 如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌),是胞内酶 ? 50~80℃，10分钟 ( 使菌体自溶的酶失活，而葡萄糖异构酶仍保持活性，长期使用酶活力不减少)。 ? 有直接用霉菌孢子固定化，或用双功能试剂将同源和异源的酶固定于菌体的细胞壁上。 如把淀粉葡萄糖苷酶偶联于含葡萄糖异构酶的链霉菌上去。用菌体直接“联合”加工淀粉成为果糖。 除上面直接固定化外，其他方法 a) 吸附方法 b) 包埋方法 c) 交联，共价偶联方法 ? 第九章 固定化酶 第九章 固定化酶 固定化例子： 酒石酸产生菌固定化 无水马来酸酐 顺式环氧琥珀酸 富马酸 固定化酶制备成功的关键： 1.需选择好载体和固定化方法。 2.控制固定化条件，不要太强烈。 3.把活性中心的必需基团保护起来，用可逆抑制 剂或者底物。 4.偶联的酶非常重要，就是偶联酶量。知 道“相对酶活力”，固定化酶前后的 活力差异。 与载体材料、固定化方法、条件、酶反应系 统的组成都有关系。 如果把上面提到的条件固定，那么偶联酶量就成为主要解决的问题。 第九章 固定化酶 第九章 固定化酶 偶联反应中的保护措施。 化学反应一般较剧烈，为了减少酶损失，可采取如下措施： 1.采用适宜的固定化材料和方法。如重氮 化注意载体的亲水性和疏水性。 2.严格控制反应条件，提高反应专一性。 如与α-氨基反应，保护其他氨基。 3.用抑制剂或底物保护酶活性中心和必需 基团避免影响酶活性构型和基团。 酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶 活力”间的平衡。 相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等原酶的活力比。 ? 因固定化时受载体、方法、条件、酶反应系统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。 1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高 2.达一定偶联量，酶过多或者集中于载体局 部造 成空间位阻，部分酶无法表现活 性。 随酶偶联量上升酶活性反而下降。 寻找二者平衡点使酶活性达到最高。 第九章 固定化酶 交联法： 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或载体间；酶分子与载体间进行交联反应而达到固定化。通常用戊二醛 第九章 固定化酶 OHC-(CH2)3-CHO+E----CH=N-E–N==CH-(CH2)3-CH==N-E-+CH- ? N N ‖ ‖ CH CH 同型的：戊二醛，最常用 异型的：甲苯-2-异氰-4-异硫氰： 交联的特点： 酶浓度低，交联发生在分子内，呈液态状。 酶浓度高，交联发生在分子间，固定化后 酶与载体成为不溶态颗粒。 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。 第九章 固定化酶 克服的方法： 1.酶先吸附在载体上或包埋在胶内、微囊 内，再交联或固定成酶膜或酶网颗粒 2.酶先在硫酸胺或者丙酮中沉淀，再交联。 第九章 固定化酶