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CRISPR/Cas9技术简介 来源简介 结构简介 工作原理简介 sgRNA克隆步骤 （整理归纳网站文献版本） 来源简介 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。（文字来源：百度百科） 结构简介 CRISPR/Cas9系统其实分为两个部分：CRISPR和Cas9。其中CRISPR是一段特殊DNA结构的序列，而Cas9为一种核酸酶。 1） CRISPR英文全称：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，即：规律成簇间隔短回文重复，也就是一种基因编辑器。它是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族。其结构如下： 其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。 Cas9: 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。Cas9含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA的两条单链，其结构简单认识为： 在Cas9的氨基末端有RuvC活性位点，在蛋白中部有HNH活性位点。这两个独特的活性位点在Cas9发挥剪切作用时至关重要。 工作原理简介 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。 在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，其中crRNA与tracrRNA退火形成的复合物能够特异性识别基因组序列，随后复合物通过PAM（Protospacer Adjacent Motif，结构特征：5’-NGG-3’。CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区（5-GG-N18-NGG-3）特征区域中的NGG位点，该位点是实现剪切功能的关键。）序列结合于目的DNA中crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，形成DNA-RNA复合结构，而另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）。 工作原理简化如下： 剪切复合体引发双链断裂（DSBs）后，细胞的非同源末端连接修复机制（NHEJ）重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变。另一种情况是，一个外源双链供体DNA片段可以通过同源重组（HR）整合进断裂处的基因组。如下图： sgRNA克隆步骤 上述识别复合体可以通过融合crRNA与tracr-RNA序列形成sg