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第四章 固定化酶和固定化细胞 （2学时） 主要内容： 1 固定化酶的定义与优点 2 酶固定化技术发展史 3 固定化酶的制备方法 4 固定化酶的特性 5 固定化活细胞 6 酶催化反应器及其类型 游离酶的使用 蒸汽→ 酶解罐简易图 加热灭酶 酶无法回收 稳定性差 1 固定化酶的定义与优点 所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。 固定化酶的优点： （1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。 2 酶固定化技术发展史 1916年，Nelson和Griffin将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液体酶同样的活性，实现了酶的固定化，可惜长期未得到重视。 1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技术迅速发展，出现了很多新的酶固定化方法。 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例。 1973年，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产。 目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力。 但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。 应用现状： 3 固定化酶的制备方法 酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。 对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。 在具体选择时，一般应遵循以下6个原则。 （1）酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，固定化时应采取尽可能温和的条件。 （2）酶与载体必须有一定的结合程度，利于反复使用。 （3）用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不易破坏或受损。 （4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。 （5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。 3.1吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法。 常用的载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋、活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。 优点：操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，固定化酶活力较高。 缺点：酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，常与交联法结合使用。 （1）物理吸附法 离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。 DEAE-纤维素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。 （2）离子吸附法 3.2包埋法 包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。 （1）凝胶包埋法 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。 1-2%海藻酸钠 +酶液 5%CaCl2溶液 （2）微胶囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。 它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。 常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。 适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。 3.3共价键结合法 共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共