11第十一章核酸体外扩增.pptVIP

第一节 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR) 一、PCR的基本原理 PCR的基本原理 示意图 二、PCR引物设计原则 PCR引物设计原则要点 1. 长度为15~30个核苷酸 2. 碱基随机分布，G+C的含量为45~55% 3. 避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不超过3bp 4. 引物之间不应存在互补序列，避免3 ′端互补重叠 5. 引物的碱基序列与非扩增区域无同源性 6. 引物3 ′端碱基一定与模板配对，最佳碱基选G和C 7. 引物5 ′端可以修饰，如加酶切位点，突变位点，起始密码子，终止密码子等。 三、模板制备 （二）RNA模板的制备 1. RNA提取试剂盒 2. 酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法 3. 异硫胍氯化铯密度梯度分离法 4. SDS-酚-氯仿法 （三）模板的取材 模板（PCR样本）可来源于病原微生物，组织细胞，血迹精斑，羊水尿样等。关于模板DNA或RNA制备请参看实验讲义。 1. 病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等 2. 病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等