实时荧光定量pcr原理课件.pptVIP

新疆海睿贝斯生物科技股份有限公司 PCR定义 PCR 简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 PCR反应条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 温度与时间的具体分析 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不