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职业教育医学检验技术专业教学资源库 第二节 血涂片制备与染色 一、血涂片制备 （一）主要器材 1．载玻片 2．推片 （二）简要操作 1． 薄血膜推片法 （1）手工推片法：采血→取血于载玻片上→推片→干燥。 取 1 小滴血于载玻片的一端（1.5cm 处或整片 1/3 处）； 推片时使推片与载玻片成 30°～45°角度，让推片接触血滴， 使血液沿推片下缘散开，再向血滴前方向匀速移动推片。 如果用力不均匀、载片不清洁可造成血涂片分布不均 合格的血涂片：厚薄适宜，头、体、尾分明，两端和两侧留有空隙，血膜至少长 30~50mm，两侧空隙 2~3mm。 （2）仪器推片法：目前有多种型号的血细胞分析仪或血细胞形态分析仪配有血涂片仪和染色仪，可以根据需要进行自动送片、取血、推片、标记和染色等操作。 2．厚血膜推片法 采血→取 1 小滴血液于载玻片中央→以推片的一角将血滴由内向外旋转涂布，制成直径约 1.5cm 的圆形厚血膜，干燥→滴加蒸馏水，溶解红细胞，脱去血红蛋白→倾去水，干燥。 （三）质量保证 1．玻片 载玻片需清洁、干燥、中性、无油腻，勿用手触及玻片表面。 2．标本 抗凝血需在 4小时内制备血涂片，否则细胞形态会发生改变。 3．制片 ①制备厚薄适宜的血涂片： 厚：血滴大、角度大、速度快—— 大、大、快 薄：血滴小、角度小、速度慢—— 小、小、慢 ②制备血膜分布均匀的血片： 血膜分布不均主要是推片边缘不齐、用力不匀和载玻片不清洁所致。 4．制片后处理 二、血涂片染色 血涂片染色是为了使血细胞着色，染料将细胞的胞膜、胞质、胞核等染成不同的颜色，便于在显微镜下观察识别。 （一）方法 1．瑞特染色法 （1）染色原理：细胞的着色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。 （2）试剂 ①瑞特染液 酸性染料伊红（伊红化钠 ） 碱性染料美蓝（氯化美蓝） 复合物溶于甲醇。 ②磷酸盐缓冲液（PBS） （pH6.4～6.8） （3）简要操作 血涂片制备 干燥、标记 加瑞特染液覆盖血膜 固定约 1 分钟 加等量缓冲液 混匀→静置 5～10 分钟 流水冲洗、干燥 （4）染色效果 正常情况下，经瑞特染色后血膜外观呈淡紫红色。 显微镜下：红细胞呈粉红色圆盘状；白细胞的细胞核染紫红色，核染色质结构清楚，胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色；血小板染成紫红色。 2．吉姆萨染色法 （1）原理：吉姆萨染色原理与瑞特染色相同，但提高了噻嗪类染料亚甲蓝的质量，加强了天青的作用。与瑞特染色法比较，该法对细胞核着色效果较好，但对中性颗粒着色较差。 （2）试剂：由吉姆萨染料、甲醇和甘油组成。 （3）简要操作：同瑞特染色法。 3．瑞-吉复合染色法 可取长补短，使血细胞获得满意的染色效果。 （二）质量保证 1．瑞特染液质量 在密封条件下，贮存时间愈久， 亚甲蓝转化的天青 B 愈多，染色效果愈好。 可用吸光度比值（RA）作为瑞特染液的质量评价指标RA=A650/A525， RA 降至 1.3±0.1即可使用。 瑞特染液需适当加入甘油，密封严实，以防止甲醇挥发或氧化，影响染液质量。 2．pH 如环境 pH＜PI（PI 为该蛋白质的等电点），易与酸性伊红结合，染色偏红；当环境的 pH＞PI 则带负电荷增多，易与亚甲蓝结合，染色偏蓝。 3．染色时机 血涂片干透后才能染色，否则易脱落。 4．染液用量 以刚好覆盖血膜为宜。用量过多，会造成深染；过少，会导致血涂片局部未着色，或易干使染料沉积。 5．混匀 染液与缓冲液需充分混匀，否则细胞着色不均。 6．染色时间 环境温度越低、细胞越多，染色时间越长；反之亦然。 7．冲洗 用小流水将染液冲洗干净，不能先倒掉染液再用流水冲洗，以免染料沉着于血涂片上，干扰血细胞形态观察。 8．脱色与复染 染色过深，可用甲醇或清水脱色。染色过浅，可以复染。 （二）质量保证 （三）方法学评价 * 甲醛的作用： ① 使ME溶解，并解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合而着色。 ② 因其具有强大的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。 ① 细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合而染成红色，因此该物质称为嗜酸性物质； ② 细胞中的酸性物质如细胞核蛋白和淋巴细胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合而染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质； ③ 中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为中性物质。 * 1. 制备血涂片2.