DNA体外合成与序列测定.pptVIP

1. 合成的原理 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。 每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。 合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。 Sanger双脱氧链终止法 Sanger双脱氧链终止法原理 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法 克服缺点的一种途径—DNA分子克隆 M13载体克隆DNA片段 荧光标记物 聚合反应及产物 单泳道电泳及信号收集 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理 Maxam－Gilbert化学修饰法优点 G反应： DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应： 甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应： 肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。 C反应： 在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。 DNA杂交测序 杂交的检测 杂交测序的应用 DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 序列的组装 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. 未来的测序技术主要包括： ★质谱法(mass spectrometry) ； ★杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH)； ★单分子测序法(single-molecule seguencing) ； ★扫描隧道显微镜(atomic probe microscopy） ； ★超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE) ； ★毛细管电泳法(capillary gel electrophoresis,CE ) ； ★芯片技术等。 “测序”思考回答问题 Maxam-Gilbert DNA化学降解法 基本原理： * 南京农业大学 生命科学学院 * 不需要体外酶催合成反应 单双链都可以 需要末端标记 两端采用不同的标记，测序可从两端进行 Maxam-Gilbert测序法的特异断裂 32P 32P ATCGATCG 32P ATCG AT ATCGAT Specific Reaction to G 化學法 無放射線片段 不能顯像 断裂处 断裂处 ATCGATCGAT 5ˊP P 5ˊ 3ˊHO OH 3ˊ 5ˊHO OH 5ˊ 3ˊHO OH 3ˊ 5ˊ32P P32 5ˊ 3ˊHO OH 3ˊ 5ˊ32P OH 3ˊ 硫酸二甲酯 甲酸 肼 肼＋NaCl G G+A T+C C 碱性磷酸单酯酶 除去 5ˊ磷酸基 多核苷酸磷酸激酶 γ-32P-ATP 分离单链DNA 分别在4个试管中进行特异断裂 G G+A T+C C 5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG 5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G 断裂产物分别在4个泳道电泳 从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列 化学降解法与双脱氧法的比较 Maxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些，通常说来，化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam-Gilbert化学降解法应用得更为广泛。但是，化学降解法具有一个Sanger 法所不具备的明显优点： 即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲