1重组DNA技术简介.ppt

D 基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 D 基因工程的基本形式 D 基因工程的支撑技术 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 + DNA （+）DNA RFDNA RFDNA RFDNA - DNA II V 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13 DNA载体的构建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13RF-DNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列载体 lacZ‘ polylinker 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13 DNA载体的特点： 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。 考斯质粒与噬菌粒 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和 1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA 的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度， 就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序 列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时 又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这 便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒 和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内 不能形成噬菌体颗粒。 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年Collins和Hohn发明构建 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI l-DNA cos序列和质粒复制子的 特殊类型的载体 cos site - carrying plasmid 1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为31 - 45 kb 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的特点： 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解受体细胞 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子 以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-MG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC