2009秋季福建-04毛细管电泳法.ppt

毛细管电泳法Capillary Electrophoresis 经典电泳最大局限性在于难以克服由于高电压引起的焦耳热。 第一节 概 述 一、毛细管电泳的沿革 1967年，瑞典科学家Hjerten CZE 1970年，Everaerts 毛细管等速电泳，但效果不足以引人关注 1974年，Virtanen 细毛细管; 1979年, Mikkers等证实; CZE 第一个重大突破 1981年，Jorgenson等 75微米内径毛细管 CZE 4?105/m 1983年，Hjerten提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法 1984年，Terabe发展了胶束电动毛细管色谱（MECC） 1986年，Lauer 蛋白质在CZE中的分离效率 106/m Automated Sequencing 二、毛细管发展新动向 方法发展方面：阵列毛细管电泳、芯片毛细管电泳、亲和毛细管电泳等 发展联用技术：CE-LIF、 CE-MS、CE-NMR 等 应用方面：DNA测序、蛋白质分析、单细胞分析、手性分离、糖分析等 三、 基本特点 优 点 高效 理论塔板数105?106/m，CGE107/m 快速 几十秒至十几分钟 微量 进样体积小到1?L，消耗体积1-50nL 样品 无机离子到整个细胞 经济 消耗几毫升缓冲溶液 缺 点 制备能力差 光路短，高灵敏度的检测器 填充管需要专门的灌柱技术 大的侧面/截面积比，放大吸附作用 吸附引起电渗变化，影响分离重现性 第二节 基本理论 毛细管电泳(CE)又称为高效毛细管电泳(HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压电直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。 一、电泳和电泳淌度 电泳(electrophoresis)：也叫电迁移(electromigration)，指在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。 电泳技术：将电泳应用于物质的分离，就形成了电泳技术或方法。 电泳为带电粒子在电场作用下在缓冲溶液中的定向移动。 uep=?ep E uep：移动速度；E：电场强度； ?ep：溶质的电泳淌度（单位电场强度下的移动速度） ?ep可近似地表达为： ε是介电常数，?是介质的粘度，?i是粒子的Zeta电位。 ?I ∝ Z/M2/3 ?i：Zeta电位 Z：表面电荷 M：摩尔质量 荷电粒子在电场作用下，依据表面电荷密度的差别，进行差速移动而实现电泳分离，这就是在自由溶液区带电泳中不同荷电粒子的分离基础。 有效淌度(effective mobility) ▲ 实际溶液中，荷电粒子的活度系数、溶质分子的解离程度均对荷电粒子的电泳淌度产生影响，此时正确的淌度值应示为有效淌度。 有效淌度?ef ： ?ef ? ?I ?i?i?ep 式中?I为样品分子的第i级解离度，?i为活度系数或其他解离常数。 二、电渗和电渗率（电渗淌度） 电渗是一种液体相对于带电管壁移动的现象 电渗的产生与双电层有关。 双电层中处于扩散层中的阳离子在毛细管内壁负离子表面形成一个圆筒形的阳离子塞流，而阳离子又是溶剂化的，在外加电场作用下，水化阳离子携带溶剂一齐向阴极迁移，形成电渗流。 电渗淌度?os ：也称电渗率，即单位电场下的电渗速度 ?os = uos/ E 电渗淌度?os可用下式表示，即： 电渗流的特点 电渗流使几乎所有的样品组分向同一方向移动 电渗流具平面流型 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速 电渗流的微小变化影响结果的重现性（在HPCE中，控制EOF非常重要！） 影响电渗流的因素 电场强度 缓冲液pH 离子强度或缓冲液浓度 温度 有机改变剂 表面活性剂 共价涂渍 电渗流的影响因素及其控制 4. 温度的影响 5. 添加剂的影响 三、表观淌度 表观淌度(apparent mobility) 在不考虑相互作用的前提下， 离子的电泳淌度和溶液的电渗淌度的矢量和 uap = uef + uos = (?ef + ?os)E ?ap = ?ef + ?os uap为表观迁移速度， ?ap为表观淌度 四、分离效率和峰加宽因素 (一)分离效率 毛细管柱效 也用塔板高度H和塔板数n表示 n可以利用峰参数直接测定: n = 5.54(tm/W1/2)2 n = Ld/H Ld为进样口至检测器的距离 tm 为流出曲线最高点所对应的时间，称为迁移时间(migration time)。