外周血的NK细胞分离培养.docVIP

外周血的 NK细胞分离培养 1. 样本采集 常规操作采集患者外周血，避免样本污染。 2. 细胞分离 超净工作台中，分装血样于 50mL离心管中，取全血样 1mL计数（3mL全血 留样）。 2000rpm离心 10min，取上层血浆于 50mL离心管（1.5mL未灭活血浆留样）。 56℃灭活 30min，3000rpm离心 10min，去沉淀后 4℃保存上清。 生理盐水 1:1 稀释混匀血细胞，缓慢加到装有 Ficill 的离心管内（界面清 晰，血样： Ficoll 不超过 2:1 ），1600rpm离心 20min。 吸弃上清，吸取白膜层到离心管，加生理盐水至 45mL，混匀后 1500rpm 离 心 10min。 吸弃上清，生理盐水重悬后合并一管，加生理盐水至 45mL。混匀，取样计 数计算细胞总量， 1800rpm离心 10min。 参照试剂盒说明书配置培养液、滋养细胞液。 3. 细胞培养（山东齐鲁细胞治疗 NK细胞培养试剂盒） 0d，T75培养瓶接种：30mL细胞悬液+NK-1试剂 培养箱培养。（接种密度 1.0-1.5*10 6/mL） 6/mL） [2] +5%自体血浆，37℃，5.0%CO 2 3d，离心换液： T75培养瓶中细胞转移至 50ml离心管 1600 rpm/min 升6 降 4 离心 10min 去除上清。细胞沉淀 +NK细胞培养液（ 30mL）+5%自体