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聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物 1 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备 大板的制备：用清水将玻璃板反复冲洗干净，晾干，用无屑纸蘸70%酒精擦洗、自然晾干。将大板铺平，倒上binding混合液(9μLbinding、9uL醋酸、1.9mL无水乙醇)，用无屑纸擦匀，晾干。两边放上边条，对齐。 耳朵板的制备：用清水将耳板反复冲洗干净，晾干，放入通风厨，用无屑纸蘸70%酒精擦干净。用少量的repel轻轻擦涂，待干，取出后将涂repel的一面向下，放在大板上，下端对齐，用夹子夹紧，用水平仪校准，使玻璃板平整。 灌胶：将聚丙烯酰胺凝胶装入灌胶瓶，加入APS，TEMED，摇匀。将灌胶瓶对准灌胶口，用均匀的力量挤压灌胶瓶，边灌胶边轻轻拍打玻璃板，使胶平整的向前流动，防止出现气泡。灌胶结束，检察灌胶口处是否有气泡，若有可用梳齿钩出。 插梳子：在灌胶口处加一些胶，防止插梳子时出现气泡。梳齿朝外从一段开始缓慢插入梳子，用夹子夹好，等待凝胶聚合。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂及配方如表所示： 聚丙烯酸胺凝胶电泳所需试剂及配方 药品 成分 配置方法 Loading Buffer 甲酰胺，49 mL EDTA(20mmol/L，PH8.0)，1 mL 溴酚蓝，0.125g 二甲苯蓝，0.125g 加水定容至50mL 10×TBE Tris，108.00g 硼酸，55.00g EDTA，7.43g 加水定容至1000mL 6％的PA胶 丙稀酰胺，114.00g 甲叉，6.00g 10×TBE，100 mL 尿素，840.84g 加水定容至2000 mL，溶解后过滤。 APS溶液 过硫酸铵，5.0g 加水定容至50 mL。 2%Repel溶液 Repel，10.0 mL 氯仿，490 mL 将Repel加入到氯仿中，混匀。 上槽液(0.33×TBE) 10×TBE，30.0 mL 加水定容至900 mL 下槽液(1×TBE) 10×TBE，100 mL 加水定容至1000 mL AgNO3溶液 硝酸银晶体，100. 加水定容至100 mL 2 电泳 (1)准备工作 胶凝好后，取下夹子，拔掉梳子，将灌胶口和上下玻璃板面擦干净，用水冲洗净，将梳子洗净，备用。 将下槽液倒入电泳槽内，将玻璃板放入电泳槽内，灌胶口朝上。用电泳槽两侧的夹板固定玻璃板，拧螺丝，螺丝的松紧度要适当，以防漏液或散热不良引起炸板。向电泳槽和玻璃板之间的空隙加入上槽液，检查是否漏液，漏液则需重新拧螺丝。 用吸管吹去灌胶口上方的凝胶残留物，防止样品被阻挡而不能进入点样孔。 (2)预电泳 在灌胶口内隔一定距离点少量Loading Buffer，打开电源，设置恒压2000V，开始预电泳。预电泳主要有两方面的作用，一是将胶内的杂质清除干净，有利于电泳的快速进行；二是通过Loading Buffer的两条带(二甲苯蓝和溴酚蓝)指示DNA样品电泳的程度。 预电泳进行约30mins，暂停电泳仪，准备电泳。 (3)电泳 将梳齿向下插入梳子，梳齿不宜插入过深或过浅，防止胶面变形或样品串到其他点样孔。用记号笔在玻璃板上按梳齿做好记号，方便点样。 吸取3~4μL PCR产物，快速加入点样孔，点完样后打开电泳仪，2000V恒压电泳。电泳过程中应监测玻璃板温度，如温度过高应及时更换上槽液或将电压调小，以降低温度，防止炸板。 根据PCR扩增产物的片段大小和Loading Buffer的位置估算电泳时间，防止样品间区分不开或样品跑出胶外。电泳结束后卸下玻璃板，将玻璃板冲洗干净，准备银染。 3 银染和显影： 固定与银染：将电泳后的胶放入银染液(0.2%的AgNO3、0.5%的冰醋酸)中缓慢平行摇动10min。 水洗：用蒸馏水水洗数秒钟。 显影：把水洗后的胶放入显影液(1.0%的NaOH、0.4%的甲醛)中，缓慢平行摇动，直至出现清晰的带型为止。显影后的胶放在灯箱上，用数码相机拍照。