单克隆抗体的制备和应用复习课程.pptVIP

单克隆抗体的制备和应用;20世纪有关抗体的生理学和医学诺贝尔奖项;B淋巴细胞杂交瘤技术是如何创立的;克隆（Clone）又名无性繁殖系，指由一个祖先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相同的细胞群;多克隆抗体（Polyclonal antibody, pAb） 用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体 单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原 决定簇的抗体，称为单克隆抗体;单克隆抗体的优点;杂交细胞（hybrid cell） 在外界某些条件干预下（如PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞 ;杂交瘤细胞（Hybridomas） 若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性 B淋巴细胞杂交瘤 骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂 交瘤细胞;B淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理;抗原制备 免疫动物 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的制备;一、抗 原; B淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。 ; 采用与骨髓瘤供体同一品系的动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。;第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂; ; 所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物  品系相同;饲养细胞的作用： ;四、细胞融合;拉颈处死小鼠 无菌操作取出脾脏 清洗、研磨 收集细胞 离心洗涤 细胞计数;收集细胞 离心洗涤 活细胞计数 调整细胞浓度;细胞融合;在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与 骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞 ;五、杂交瘤细胞的选择性培养;; 用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK ，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得到HGPRT和TK 的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成DNA，而在HAT选择培养液中生长繁殖。;; 融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。 融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。;六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化;; 杂交瘤细胞的克隆化 ;有限稀释法 ; 软琼脂培养法 以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养 基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。;杂交瘤细胞的克隆化筛选：; 免疫球蛋白类别及亚类的鉴定 ; 抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。;八、单克隆抗体的制备 ;约1~2周, 可见小鼠 腹部膨大。用注射器 抽取腹水，即可获得 大量单克隆抗体。 ; 将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。;我国单克隆抗体的发展历史和前景;单克隆抗体的应用;单克隆抗体在生命科学和医学中的广泛应用; 传染性疾病 HIV: 急性感染期和晚期: 核心抗原p24升高; 检测抗HIV抗体初筛; 免疫印迹进一步确认; CD4+T 细胞200/?l病情严重 HAV、HBV、HCV: 抗体 HFRS: 免疫荧光，ELISA（特异性IgM） 肿瘤 多种肿瘤的标志物