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薄层色谱扫描法 中药二室  一、薄层色谱扫描法简介 二、影响薄层扫描定量的因素 三、介绍CAMAG薄层扫描仪 一、薄层色谱扫描法简介 1、简述 薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收强度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。  中药材：山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等； 中成药：六味地黄丸（浓缩丸）、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、 九分散等; 2、检测方法 (1)吸收法:扫描时测定薄层板上的样品斑点对光吸收强度的方法。 (2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧光强度的方法。 (3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂 中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对定量不太适用,而是便于斑点的定位。 3、测量方式 (1)透射法：测定照射光穿透样品斑点后光的吸收情况。 (2)反射法：样品斑点对照射光的反射情况进行测定的方法。 4、测光形式 (1)单波长扫描：使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描：用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层 板的背景干扰，能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。 5、扫描方式 (1)线性扫描：用一束比待测斑点略宽的狭窄 光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状 较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般 只用线性扫描。 (2)锯齿扫描：使用微小正方形光束沿展开方 向扫描的同时，在垂直于展开方向进行往复 式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿 形或矩形，它对于形状不规则或分布不均匀 的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。 6、定量方法 (1)外标法：如果标准曲线经过原点，可用一点法校正；如 果不通过原点，采用二点法校正，必要时用多点校正法。测 定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上， 每份供试品溶液点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少 于2个，其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式: C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法：将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难，目前应 用较少。 内标物：a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的， b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物， 7、系统适用性试验 （1）检测灵敏度：指用于限量检查时，被测成分能 被检出的最低量。 （2）分离度：用于限量检查或含量测定时，要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 （3）重复性：指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。不显色直接扫 描，相对标准偏差应不大于3.0%，显色后扫描，相 对标准偏差应不大于5.0%。 二、影响薄层扫描定量的因素 （一）吸附剂性能及薄层质量 1、吸附剂： （1）吸附剂颗粒大小，分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂，分离度 好，灵敏度高。 （2）吸附剂的含水量影响薄层活度，如果大气湿度 过大，吸附剂含水量过高，导致薄层活度过低，就 会影响分离效果，所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。 （一）吸附剂性能及薄层质量 2、薄层：薄层厚度会影响定量结果，厚度下 降，展开后斑点扩散较严重，影响定量结果。 用透射法测定时，峰面积值随薄层厚度下降 而减小，用反射法测定，峰面积值随薄层厚 度下降而增加。 因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。 薄层板的种类 硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂； 硅胶GF254板是添加荧光指示剂；常用的荧光指示剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn）,在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫化锌、硫化镉（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波长下能发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。 硅胶H板是没有外加黏合剂。 氧化铝板以氧化铝作为固定相，可以分离萜类，生物碱类，脂肪族及芳香族化合物。 （二）点样 1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线距底边10-15mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10m