原核表达及蛋白纯化方法.docx

蛋白原核表达 预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度 1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。 2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。 3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。 4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的） 5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。 6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL