副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(pfge)标准操作方案.docVIP

钟，或室温溶解约 2 小时，使充分溶解后调体积至终体积。 4、 0.5×TBE Buffer 200 ml 5×TBE 用纯水稀释到 2000 ml 或 100 ml 10×TBE 用纯水稀释到 2000 ml 注意：用来稀释 5×TBE、10×TBE 的纯水可以不灭菌。 5、 SeaKem Gold Agarose ? 凝胶块琼脂糖(1%SeaKem Gold，以 TE 配制： 1 称 0.50g（或 0.25g）SeaKem Gold（SKG）于 250ml 螺帽瓶中。 2 加入 50ml（或 25ml）TE 缓冲液，轻旋转瓶以分散 SKG 胶。 3 取下瓶盖，用干净膜盖住瓶口，微波加热 30 秒，轻轻混合；每隔 10 秒重复一次，直到胶完全熔化。 4 盖好瓶口，保温于 55-60℃水浴备用。 注意：SeaKem Gold 琼脂糖制 PFGE 凝胶块效果较好，用可重复制胶模 具制备的凝胶块强度较大，裂解和洗胶时凝胶块损伤较少。完全熔化琼 脂糖需要的时间和温度取决于所用微波，需要实验室经验确定。 ? 电泳胶(1% SeaKem Gold，以 0.5×TBE 配制： 1 称适量 SKG 胶于 500ml 螺帽瓶中。 2 加入适量 0.5×TBE，轻旋转瓶以分散 SKG 胶。 3 取下瓶盖，用干净膜盖住瓶口，微波加热 60 秒，轻轻混合；每隔 15 秒重复一次，直到胶完全熔化。 4 盖好瓶口，保温于 55-60℃水浴备用。 14cm 宽电泳胶框（10-15 加样孔） ：1.0gSKG 胶溶于 100ml0.5×TBE 中； 21cm 宽电泳胶框（≥15 加样孔） ：1.5gSKG 胶溶于 150ml0.5×TBE 中。 附录 4：器材与耗材 器 材： 1、Dade Microscan Turbidity Meter Spectrophotometer bioMérieux Vitek Colorimeter ——调整细胞悬浊液的浓度 2、微波炉 3、水浴摇床 ——溶胶 ——裂解胶块中的细胞(54°C ——用水和 TE(50°C洗胶块 4、56°C 水浴箱 5、50°C 水浴箱 6、离心机。 7、最少两个水浴箱 ——一个平衡到 56°C，另一个到 37°C。如果需要，温度可 以上下调动。 耗 材： ——平衡和保温熔化的胶 ——加热用于洗胶块的水和 TE，酶切 1、无菌的 Falcon 2054（12-mm x 75-mm）或 Falcon 2057（17-mm x 100-mm） ——用于细胞悬浊液的制备。 2、无菌的聚酯纤维或棉签 ——用于从琼脂平板上刮取细菌 3、无菌的枪头或巴斯得吸管 4、无菌的 1.5 ml 离心管 ——用于混合细胞悬浊液和胶、酶切 5、无菌的 50 ml screw-cap tubes 或 50 ml Oak Ridge tubes ——用于装胶块 6、Green Screened Caps（Bio-Rad 1703711）——洗胶块时用 7、模具 －10 孔（可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm） －50 孔（一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm） 8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物 ——用于切胶块 9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片——用于切胶块 10、一端宽、一端窄的平铲（微量药铲） ；胶铲（Bio-Rad170-3643） 11、标准灌胶台（14 x 13cm） ：适用于 10 孔的梳子 大灌胶台（21 x 14cm，Bio-Rad170-3704） ：适用于 15 孔的梳子 12、 10 孔的梳子 （14 cm 长， 1.5 mm 厚， Bio-Rad170-4326） 或 15 孔的梳子 （21cm 长，1.5 mm 厚，Bio-Rad170-3627） 13、水平台 14、盛放 EB 染液的容器 15、70％异丙醇、5%－10%的漂白剂或其它合适的消毒剂 16、各种体积的无菌烧瓶或瓶子（50 ml - 2000 ml） 17、各种规格的无菌量筒（100 ml - 2000 ml） 18、无菌的吸管（2 ml - 50 ml） 19、保护性手套（无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套） 20、防热性手套 21、冰盒 附录 5：PFGE 记录表格（见下页） PFGE 记录表格 菌株上送单位: 图像递交实验室名称: 菌株接收日期: PFGE 日期: 报告结果日期: 凝胶图像编号: Conditions Run Time Initial Switch Time Final Switch Time Voltage Gradient Included Angle Ramping 起始电流(ma 插入凝胶图像 19hr 12.6sec 30.8sec 6 V/cm