基因克隆载体.pptxVIP

基因克隆载体;一、概念;二、基因克隆载体必须具备的条件;随着分子生物学技术的发展,越来越多的克隆载体相继出现 ,这些载体的发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究。同时随着人类基因组计划和植物基因组计划的实施 ,克隆载体的整体结构、克隆能力和转化效率等都有了长足的发展。可以把克隆载体的发展划分为三个阶段 :;第一阶段以质粒、λ噬菌体、柯斯质粒为主,主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高 ,但是克隆容量有限 ,一般小于 45kb 。 第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量,显著特点是载体的容载能力扩大,约100～350kb ,主要有酵母人工染色体、细菌人工染色体、以及源于噬菌体 P1的人工染色体。 第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染色体(BIBAC)和可转化人工染色体(TAC),这些载体不仅具有较大的克隆容量 ,而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。;四、常用克隆载体;1、质粒载体;（2）质粒的不亲和性： 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒。 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒。;（3）质粒的可转移性： 是指在自然条件下，质粒可以通过细菌的接合作用转移到新宿主内，根据质粒的转移性，将质粒分为： 接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞，如F、Col、R质粒等。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 ;（4）迁移作用 某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，发生DNA转移的过程。 （5）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。;（6）质粒的构建： 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 构建原则 ： 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单 ;（7）重要的大肠杆菌质粒载体： pBR322质粒载体： （1）较小的分子量，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA。 （2）带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 （3）较高的拷贝数，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 （4）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。;pUC质粒载体： （1）分子量更小、拷贝数更高。 （2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时。 （3）装有多克隆位点（MCS），方便转移外源DNA在不同载体系列中穿梭，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入pUC载体。 （4）选择颜色标记 lacZ’，用于基因克隆和测序。 ;2、噬菌体载体;（2）噬菌体的生长周期：溶菌周期、溶源周期 溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。 在溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。只有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 ;（3）?噬菌体 生物学特征 DNA为线状双链DNA分子，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点。 ?噬菌体构建的基本策略: 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统; ?噬菌体DNA作为载体的优点： ?DNA在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 ?DNA载体的装载能力为25 kb，远大于质粒的装载量 重组?DNA分子的筛选较为方便 重组?DNA分子的提取较为简便 ?DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因 λ噬菌体克隆载体的应用 建立cDNA基因文库：转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。效率高。转染(transfection) 指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。 克隆外源目的基因 ; （4）