第7章 现代生物技术(二).pptxVIP

人工基因组的设计与合成;第七章 现代生物技术(二);第八章 现代生物技术(二);DNA重组技术;载体;载体必须具备的基本条件;;载体的分类;质粒 (plasmid);1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。 2、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 ;3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 4、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。; pBR322质粒;抗药性标志的选择;;;;底盘细胞（宿主）;底盘细胞的特征;常见的天然底盘;重组DNA的转入;（1） Ca2+诱导的大肠杆菌转化法;（2）电穿孔转化法;重组子的筛选;常见筛选方法;抗性筛选;插入失活筛选;;限制性内切酶图谱  限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。;PCR鉴定;凝胶电泳技术;核酸凝胶电泳的基本原理;凝胶电泳种类;琼脂糖凝胶电泳;不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围;聚丙烯酰胺凝胶电泳;DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围;PCR技术;;thermus aquaticus;;;;;;;;;; ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 ;PCR技术;PCR技术;引物设计的一般原则;（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析;不对称PCR; ;反向PCR (reverse PCR) ;; RT-PCR（reverse transcriptional-PCR): 反转录PCR：是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。;多重PCR(multiplex PCR);重叠延伸PCR (Overlap Extension PCR);实时定量PCR (Real Time PCR);62;重点;The End！