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实验十一 鸡血细胞融合 实验目的 掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。 实验用仪器及材料 实验仪器及材料 一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4) 实验原理 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、电脉冲和激光诱导。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。 PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可以改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生聚散和重组，引起细胞融合。 融合的频率和活力与所使用的PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等相关。 实验步骤 (1)取鸡血储备液1mL，加入4mL0.85％生理盐水，混匀，1200rpm/min 离心5min，弃去上清液。 (2)加入5mLGKN工作液制成鸡血细胞悬液。 (3)取1mL鸡血细胞悬液，加入4mLHanks液混匀，1000rpm/min离心5min，去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团快松散。 (4)取50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内逐滴加入到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后37℃水浴静置2分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 (5)缓慢加入5ml Hanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴内静置5分钟以终止PEG的作用，。 (6)用吸管轻轻吹打细胞团快数次使细胞团分散，1000转离心5min，弃去多数上清液，留少许溶液混匀，取一滴融合后的细胞悬液滴片，滴加一滴詹纳斯绿染液或者Giemsa染液，加盖片镜检。 数据记录 结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。 融合的各个阶段：部分融合、全部融合 要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 融合率的计算 在高倍镜下随机计数100个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下： 作业 在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。 你测定的细胞融合率为多少? * *