基因表达分析.ppt

生物学领域几乎无处不用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学领域 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测） 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 原位杂交技术（in situ hybridization,ISH） 原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置 (a) Somatic chromosome and nuclei of Allium fistulosum after DAPI staining and fluorescence in situ hybridization with labelled non-coding satellite sequences (green signals for Alexa 488) and 45S rDNA (red signals for rhodamine) using conventional detection systems. (b) A. fistulosum chromosomes after in situ hybridisation with the same probes. The biotinylated non-coding satellite probe was detected with QD 565 streptavidin conjugate (green signal, arrowed) yielding only very weak and few signals. In contrast, the conventional antibody detection of 45s rDNA loci (in red) resulted in a strong hybridization signal. Müller et al. Journal of Nanobiotechnology 2006 4:5 ? doi:10.1186/1477-3155-4-5 （三）基因表达的定量及定性分析 RNA的定性与定量分析 蛋白质的定性与定量分析 RNA的定性与定量分析 Northern blot Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 RT-PCR 是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析。 蛋白质的定性与定量分析 Western blot SDS和Western分析 步骤： 收集蛋白 样品 电泳 转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 蛋白检测 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 流式细胞术 流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）可在细胞水平上分析特定蛋白质 流式细胞术（flow cytometry） 免疫组化 免疫组化(immunohistochemistry) 可对细胞内或组织中的特定基因表达产物进行定位和半定量分析 生物芯片 生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白